ניתוח של הפרעה פנימית AtHIRD11 ואיגוד לקראת יוני מתכת על ידי נימי אלקטרופורזה בג'ל אלקטרופורזה נימי זיקה
Summary
פרוטוקול זה משלב האפיון של מדגם חלבונים על ידי אלקטרופורזה בג’ל נימי הקרנה מחייב מהיר עבור ליגנדים טעון על ידי אלקטרופורזה נימי זיקה. מומלץ חלבונים עם מבנה גמיש, כגון חלבונים המתוסבכים ממהותם, כדי לקבוע את כל ההבדלים ביומן מחייב עבור conformers שונים.
Abstract
הצמחים תלויים חריפה לסביבה שלהם. על מנת להסתגל לשינויים מלחיץ (למשל, הבצורת, מליחות גבוהה), צמחים להתפתח כיתות של חלבונים המתוסבכים מהותית (IDPs) כדי להפחית סטרס חמצוני, osmotic. מאמר זה משתמש בשילוב של נימי בג’ל (CGE) ניידות shift זיקה אלקטרופורזה (ACE) כדי לתאר את התנהגות מחייב conformers שונים של AtHIRD11 IDP מ תודרנית לבנה. CGE משמש כדי לאשר את הטוהר של AtHIRD11 כדי לא לכלול שברים, שינויים posttranslational, זיהומים אחרים כמו סיבות דפוסי השיא מורכב. בחלק זה של הניסוי, הרכיבים דגימה שונים המופרדים באמצעות ג’ל צמיגה בתוך נימי על ידי ההמונים שונים שלהם, מזוהה עם גלאי מערך דיודות. לאחר מכן, אופן הפעולה של איגוד של המדגם כלפי יונים מתכתיים שונים נחקר על ידי אס. במקרה זה, ליגנד נוסף את בופר, המשמרת בזמן ההעברה נמדד על מנת לקבוע אם התרחש אירוע מחייב או לא. אחד היתרונות של שימוש השילוב של CGE ו- ACE כדי לקבוע את אופן הפעולה של איגוד של IDP הוא האפשרות להפוך את בג’ל ו איגוד וזמינותו. יתר על כן, CGE מראה מגבלה נמוכה יותר של זיהוי מאשר בג’ל קלאסית ו ACE יש אפשרות לקבוע את סיבת איגוד של ליגנד בצורה מהירה. בנוסף, ניתן להחיל ACE גם למינים אחרים טעונים יותר יונים מתכתיים. עם זאת, השימוש בשיטה זו עבור איגוד ניסויים היא מוגבלת ביכולתה לקבוע את מספר אתרי קישור. ובכל זאת, השילוב של CGE ו ACE ניתן להתאים עבור אפיון ההתנהגות איגוד של דוגמה חלבון לכיוון ליגנדים טעונה רבים.
Introduction
צמחים הם תלויות יותר לסביבתם מאשר צורות חיים רבות אחרות. מאז צמחים לא ניתן להעביר למקומות אחרים, הם נאלצים להסתגל לשינויים בסביבתם (למשל, הבצורת, ריכוז המלח גבוה וקר). כתוצאה מכך, צמחים פיתח חלבונים מיוחדים מתח כמו dehydrins, אשר למלא משימות סעפת להפחתת מתח התא הקשורים מליחות גבוהה. חלבונים אלה לאגד מים, יונים בתוך תאים, להפחית סטרס חמצוני על-ידי כריכת Cu2 +-יונים, אינטראקציה עם פוספוליפידים, כמו גם את cytoskeletons. יתר על כן, איגוד Zn2 +-יונים מאפשר חלבונים אלה לשמש גורמי שעתוק. היכולת שלהם לאגד Ca2 +-יונים לאחר זרחון היה גם דיווח1.
ההתנהגות משולבות של חלבונים אלה קשורה העדר של חומצת אמינו הידרופוביות משקעים. כתוצאה מכך, הם חסרי כל אינטראקציות הידרופוביות בתוך הרשת פפטיד, גם מבנה מאולצות. עם זאת, כי חלבונים אלה חסרים מבנה מגבילות, הם יכולים לכבוש conformers שונים תחת באותם התנאים. לכן, הם ניתן לתאר בצורה הטובה ביותר כמו הרכב של מבנים, ולא עם קונפורמציה יחיד. חלבונים עם מאפיינים אלה ידועים כמו ממהותם סמוקים חלבונים (IDPs) הם רעיון בשימוש נרחב עבור מתח חלבונים ואת crosstalk בין מסלולים שונים התאים האיקריוטים2.
אחד IDPs אלה הקשורות ללחץ הוא AtHIRD11. זה אחד של תודרנית לבנהרוב מאוד לידי ביטוי בצורת IDPs. לפיכך, ניתן להפריד את conformers שונים על ידי שלהם רדיוס אפקטיבי לחייב יחס, נימי אלקטרופורזה (CE) שימש לחקירה נוספת. ניסויים אייס קודמות הדגימו את האינטראקציות בין AtHIRD11 יונים של מתכות המעבר כגון Cu2 +-, Zn2 +-, Co2 +2 +Ni-יונים. ניתן למצוא את התוצאות המפורטות ב. ההרה et al. 3 ו. Nachbar et al. 4.
שיטת אס שבה ייעשה שימוש כאן מבוסס על עבודותיו שפורסמו קודם לכן6. עם זאת, התוספת של acetanilide סמן EOF לדגימת חלבון אינה מתאימה. AtHIRD11 מראה רחב שיא תבניות, הוספת סמן EOF המדגם להסוות שתי הפסגות. לכן, משמש הסמן ריצה נפרדת. לפני הפעולה מחייב נבדק, הוא אישר כי הפסגות נמצאו במהלך ניסויים קודמים הם מן conformers שונים. לפיכך, CGE משמש כדי להבחין בין conformers חלבון, ששינה post-translational חלבון, זיהומים, כמו שברי AtHIRD11, על-ידי ההמונים שלהם שונה. לאחר מכן, התנהגות AtHIRD11 של המדגם מאופיין מחייב כלפי שונים יונים מתכתיים שונים הוא חקר.
מטרת המאמר היא לתאר את התקנה ניסיונית להבחין בין IDP ורכיבים אחרים של מדגם על מנת להעריך את ההבדלים בהתנהגות איגוד של conformers שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבור כל הניסויים לסה נ, הכנת נימי הוא שלב קריטי. מאז זה צינור זכוכית עם קוטר קטן, יכול להינתק בקלות בנקודות היכן הציפוי יוסר בעת זה בטיפול. התקנת נימי לתוך הכלי צריך להיעשות בזהירות רבה.
הצעדים קריטיים הכרוכים אייס בשיטת בעיקר מתייחסים הגדרת הניסוי. עוד צעד קריטי הוא מציאת הפ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו אסירי תודה Masakuza ההרה (מחקר מכון של ירוק המדע והטכנולוגיה, אוניברסיטת של שיזאוקה, יפן) למתן את דגימות חלבון AtHIRD11.
Materials
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | – | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
References
- Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
- Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
- Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
- Nachbar, M., et al. Metal ion – dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
- Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
- Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
- Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
- Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
- Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
- Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
- Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
- Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).
