Análisis de AtHIRD11 trastorno intrínseco y vinculante hacia los iones del Metal por electroforesis capilar y afinidad de electroforesis capilar
Summary
Este protocolo combina la caracterización de una muestra de proteínas por electroforesis capilar y la proyección rápida Unión de ligandos cargados por electroforesis capilar de afinidad. Se recomienda para las proteínas con una estructura flexible, como las proteínas intrínsecamente desordenadas, para determinar las diferencias en el enlace de diferentes conformadores.
Abstract
Plantas dependen fuertemente de su entorno. Con el fin de adaptarse a los cambios estresantes (por ejemplo, la sequía y salinidad), las plantas superiores evolucionan las clases de las proteínas intrínsecamente desordenadas (PID) para reducir el estrés osmótico y oxidativo. Este artículo utiliza una combinación de la electroforesis capilar (CGE) y electroforesis de afinidad de turno de movilidad (ACE) para describir el comportamiento del enlace de diferentes Conformadores de la IDP AtHIRD11 de Arabidopsis thaliana. CGE se utiliza para confirmar la pureza de AtHIRD11 y excluir fragmentos, modificaciones postraduccionales y otras impurezas como razones de patrones complejos de pico. En esta parte del experimento, los componentes diferentes de la muestra se separan por un gel viscoso dentro de un tubo capilar por sus diferentes masas y detectados con un detector de diodo array. Después, el comportamiento del enlace de la muestra a diversos iones metálicos es investigado por ACE. En este caso, el ligando se agrega a la solución tampón y se mide el cambio en el tiempo de la migración para determinar si un enlace ha ocurrido o no. Una de las ventajas de utilizar la combinación de CGE y ACE para determinar el comportamiento del enlace de un IDP es la posibilidad de automatizar la electroforesis en gel y el ensayo de enlace. Además, CGE muestra un límite inferior de detección de la electroforesis del gel del clásico y ACE es capaz de determinar la forma de unión de un ligando de una manera rápida. Además, ACE puede aplicarse también a otras especies cargadas de iones metálicos. Sin embargo, el uso de este método para atar los experimentos está limitado en su capacidad para determinar el número de sitios de Unión. Sin embargo, la combinación de CGE y ACE puede ser adaptada para caracterizar el comportamiento del enlace de cualquier muestra de proteína hacia numerosos ligandos cargados.
Introduction
Las plantas son más dependientes de su entorno que muchas otras formas de vida. Puesto que las plantas no se pueden mover a otros lugares, tienen que adaptarse a los cambios en su entorno (por ejemplo, sequía, frías y altas concentraciones de sal). En consecuencia, las plantas superiores desarrollan proteínas estrés especializados como dehidrinas, que cumplan múltiples tareas para reducir el estrés celular relacionadas con alta salinidad. Estas proteínas unen el agua y los iones dentro de las células, reduce el estrés oxidativo atando Cu2 +-los iones e interactuar con los fosfolípidos, así como los citoesqueletos. Además, enlace Zn2 +-los iones permite a estas proteínas actuar como factores de transcripción. Su capacidad Ca2 +-iones después de fosforilación también ha sido informaron1.
El comportamiento de múltiples funciones de estas proteínas está relacionada con la ausencia de residuos de aminoácidos hidrofóbicos. En consecuencia, carecen de cualquier interacción hidrófoba dentro de la cadena peptídica y también una estructura restringida. Sin embargo, porque estas proteínas tienen una estructura restrictiva, que ocupan diferentes conformadores en las mismas condiciones. Por lo tanto, puede describir mejor como un conjunto de estructuras en lugar de una conformación única. Proteínas con estas propiedades se conocen como intrínsecamente desordenadas proteínas (IDP) son un concepto ampliamente utilizado para las proteínas de estrés y diafonía entre caminos diferentes en las células eucariotas2.
Uno de estos desplazados internos relacionados con el estrés es AtHIRD11. Es uno de los desplazados de altamente expresada por sequía más de Arabidopsis thaliana. Por lo tanto, los diferentes conformadores pueden ser separados por su radio eficaz para cargar cociente y electroforesis capilar (CE) se ha utilizado para otras investigaciones. Experimentos anteriores ACE demostraron las interacciones entre los iones de metales de transición tales como Cu2 +– Zn2 +-, Co2 +y Ni2 +y AtHIRD11-iones. Los resultados detallados se pueden encontrar en Hara et al. 3 y Nachbar et al. 4.
El método ACE que se utilizará aquí se basa en nuestros anteriores trabajos publicados6. Sin embargo, la adición de la acetanilida marcador de EF a la muestra de proteína no es conveniente. AtHIRD11 muestra patrones de amplio pico, y agregar el marcador de EF a la muestra disimular dos picos. Por lo tanto, el marcador se utiliza para un funcionamiento independiente. Antes de que se examina el comportamiento del enlace, se confirma que los picos encontrados en experimentos anteriores son de diferentes conformadores. Así, CGE se utiliza para distinguir entre los Conformadores de la proteína, el poste-de translación modifica las proteínas y las impurezas, tales como fragmentos de AtHIRD11, por sus diferentes masas. Posteriormente, se investiga el comportamiento del enlace de la muestra de AtHIRD11 caracteriza a diversos iones metálicos diferentes.
El propósito de este artículo es describir una instalación experimental para distinguir entre un IDP y otros componentes de una muestra para evaluar las diferencias en el comportamiento del enlace de diferentes conformadores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para todos los experimentos de CE, la preparación del tubo capilar es un paso crítico. Puesto que es un tubo de vidrio de pequeño diámetro, que se rompa en los lugares donde la capa se elimina cuando se manipula. La instalación del tubo capilar en el instrumento debe hacerse muy cuidadosamente.
Los pasos críticos en el método as principalmente corresponden a la configuración experimental. Otro paso fundamental es encontrar los parámetros de inyección de muestra adecuado. La cantidad …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecimiento agradecemos Masakuza Hara (Instituto de investigación de verde ciencia y tecnología, Universidad de Shizuoka, Japón) para proporcionar las muestras de proteína AtHIRD11.
Materials
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | – | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
References
- Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
- Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
- Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
- Nachbar, M., et al. Metal ion – dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
- Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
- Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
- Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
- Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
- Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
- Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
- Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
- Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).
