दंत प्रत्यारोपण के लिए विभिंन सामग्रियों पर मौखिक फिल्म गठन
Summary
यहां, हम दंत कृत्रिम अंग अंग abutments के लिए टाइटेनियम और zirconia सामग्री पर मौखिक फिल्म गठन का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद, बैक्टीरियल कोशिकाओं व्यवहार्यता और रूपात्मक विशेषताओं का विश्लेषण भी शामिल है । एक में सीटू मॉडल शक्तिशाली माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ जुड़े मौखिक फिल्म विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है.
Abstract
दंत प्रत्यारोपण और उनके कृत्रिम घटकों बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण और फिल्म गठन के लिए प्रवण हैं । सामग्री है कि कम माइक्रोबियल आसंजन प्रदान करता है का उपयोग पेरि प्रत्यारोपण रोगों की व्यापकता और प्रगति को कम कर सकते हैं । मौखिक पर्यावरण जटिलता और मौखिक फिल्म विविधता को ध्यान में रखते हुए, सूक्ष्म तकनीक की जरूरत है कि दांत और दंत सामग्री की सतहों के एक फिल्म विश्लेषण को सक्षम कर सकते हैं । यह लेख कृत्रिम abutments के लिए टाइटेनियम और सिरेमिक सामग्री पर मौखिक फिल्म के गठन की तुलना के लिए कार्यांवित प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला का वर्णन करता है, साथ ही साथ मौखिक में शामिल तरीके रूपात्मक और सेलुलर स्तर पर फिल्म विश्लेषण । इस अध्ययन में वर्णित के रूप में दंत कृत्रिम अंग अंग abutments के लिए टाइटेनियम और zirconia सामग्री पर मौखिक फिल्म गठन का मूल्यांकन करने के लिए सीटू मॉडल में ४८ एच की फिल्म के एक संतोषजनक संरक्षण प्रदान करता है, जिससे methodological पर्याप्तता का प्रदर्शन. Multiphoton माइक्रोस्कोपी परीक्षण सामग्री पर गठित की गई फिल्म के एक क्षेत्र प्रतिनिधि के विश्लेषण की अनुमति देता है. इसके अलावा, fluorophores और multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवियों के प्रसंस्करण का उपयोग सूक्ष्मजीवों की एक बहुत विषम जनसंख्या में बैक्टीरियल व्यवहार्यता के विश्लेषण की अनुमति देता है । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए जैविक नमूनों की तैयारी जैव फिल्म के संरचनात्मक संरक्षण, अच्छा संकल्प के साथ छवियों, और कोई कलाकृतियों को बढ़ावा देता है ।
Introduction
बैक्टीरियल फिल्म जटिल, कार्यात्मक और संरचनात्मक रूप से संगठित माइक्रोबियल समुदायों रहे हैं, एक extracellular, जैविक रूप से सक्रिय बहुलक मैट्रिक्स1,2कि संश्लेषण माइक्रोबियल प्रजातियों की विविधता की विशेषता । बायोटिक या अजैव सतहों के लिए बैक्टीरियल आसंजन अधिग्रहीत पतली झिल्ली के गठन से पहले है, मुख्य रूप से लार से मिलकर नच1,3,4. सूक्ष्मजीवों और पतली झिल्ली के बीच कमजोर भौतिक बातचीत शुरू में स्थापित कर रहे है और बैक्टीरियल adhesins और अधिग्रहीत पतली झिल्ली के ग्लाइकोप्रोटीन रिसेप्टर्स के बीच मजबूत बातचीत के बाद । माइक्रोबियल विविधता धीरे coaggregation माध्यमिक कॉलोनाइजरों के पहले से ही संलग्न जीवाणुओं के रिसेप्टर्स के माध्यम से बढ़ जाती है, एक multispecies समुदाय बनाने1,3,4, 5.
ओरल microbiota के Homeostasis और उसके सहजीवी संबंध की मेज़बानी के साथ मौखिक स्वास्थ्य को बनाए रखने में महत्वपूर्ण है. मौखिक dysbiosis के भीतर फिल्म क्षय और periodontal रोग2,5के विकास के लिए खतरा बढ़ सकता है । नैदानिक अध्ययन दांत या दंत प्रत्यारोपण और मसूड़े की सूजन या पेरि-प्रत्यारोपण mucositis6,7के विकास पर फिल्म के संचय के बीच एक कारण और प्रभाव संबंध प्रदर्शित करता है । भड़काऊ प्रक्रिया की प्रगति पेरि-implantitis और प्रत्यारोपण8के फलस्वरूप नुकसान होता है ।
दंत प्रत्यारोपण और उनके कृत्रिम घटकों बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण और फिल्म गठन9के लिए प्रवण हैं । एक रासायनिक संरचना और सतह स्थलाकृति है कि कम माइक्रोबियल आसंजन प्रदान करता है के साथ सामग्री के उपयोग के प्रसार और पेरि प्रत्यारोपण रोगों9,10की प्रगति को कम कर सकते हैं । टाइटेनियम प्रत्यारोपण के लिए कृत्रिम abutments के निर्माण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया सामग्री है; हालांकि, चीनी मिट्टी सामग्री हाल ही में शुरू किए गए थे और क्योंकि उनके सौंदर्य गुण और11संगतता,12के टाइटेनियम के लिए एक विकल्प के रूप में लोकप्रियता प्राप्त कर रहे हैं । इसके अलावा महत्वपूर्ण बात, सिरेमिक सामग्री एक माना जाता कम क्षमता के साथ जुड़ा हुआ है सूक्ष्मजीवों का पालन करने के लिए, मुख्य रूप से उनकी सतह किसी न किसी की वजह से, गीला, और सतह मुक्त ऊर्जा10,13।
इन विट्रो अध्ययनों में कृत्रिम abutment सतहों के लिए माइक्रोबियल आसंजन की समझ में महत्वपूर्ण प्रगति के लिए योगदान दिया है9,14,15,16,17। हालांकि, मौखिक गुहा के गतिशील वातावरण, इसके अलग तापमान और पीएच और पोषक तत्वों की उपलब्धता, साथ ही कतरनी बलों की उपस्थिति के द्वारा विशेषता है, में reproducible नहीं है इन विट्रो प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल18में, 19. शी. इस समस्या को दूर करने के लिए, एक विकल्प है, जो कि पूर्व वीवो विश्लेषण के लिए अपने तीन आयामी संरचना को बरकरार रखता है के लिए, एक वैकल्पिक के रूप में , के लिए है । 21 , 22 , 23 , 24.
मौखिक सब्सट्रेट पर गठित फिल्म के जटिल संरचना के विश्लेषण ऑप्टिकली सघन बात25प्रदर्शित करने में सक्षम सूक्ष्म तकनीक के उपयोग की आवश्यकता है. Multiphoton लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी फिल्म संरचनात्मक विश्लेषण26के लिए एक आधुनिक विकल्प है । यह अवरक्त तरंग दैर्ध्य के करीब एक रोशनी स्रोत के साथ रैखिक प्रकाशिकी के उपयोग की विशेषता है,27femtoseconds को स्पंदित । इस विधि autofluorescence सामग्री या fluorophores द्वारा चिह्नित सामग्री के छवि अधिग्रहण के लिए संकेत दिया है, गैर रेखीय ऑप्टिकल एक दूसरी सुरीले पीढ़ी के रूप में जाना जाता घटना से व्युत्पंन संकेतों द्वारा उत्पंन छवियों के अलावा । multiphoton माइक्रोस्कोपी के लाभों के अलावा महान छवि उत्तेजना प्रकाश27की तीव्रता की वजह से न्यूनतम कोशिका क्षति के साथ प्राप्त गहराई है.
multiphoton माइक्रोस्कोपी द्वारा अजैव सतहों पर फिल्म की व्यवहार्यता विश्लेषण के लिए, अलग वर्णक्रमीय विशेषताओं और बैक्टीरियल कोशिकाओं में एक पैठ क्षमता के साथ फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड रंजक का उपयोग28की आवश्यकता है । Fluorophores SYTO9 (ग्रीन-फ्लोरोसेंट) और propidium आयोडाइड (रेड-फ्लोरोसेंट) जीवित और मृत बैक्टीरिया28,29,30के बीच एक दृश्य भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । Propidium आयोडाइड क्षतिग्रस्त झिल्ली के साथ ही बैक्टीरिया प्रवेश, जबकि SYTO9 एक बरकरार है और समझौता झिल्ली के साथ बैक्टीरियल कोशिकाओं में प्रवेश करती है । जब दोनों रंजक एक सेल के अंदर मौजूद हैं, propidium आयोडाइड न्यूक्लिक एसिड और विस्थापन SYTO9 के लिए एक बड़ा संबंध है, यह लाल28,30अंकन ।
मौखिक पर्यावरण जटिलता और मौखिक फिल्म विविधता को ध्यान में रखते हुए, सूक्ष्म तकनीक की जरूरत है कि दांत और दंत सामग्री की सतहों के लिए इस फिल्म के विश्लेषण को सक्षम कर सकते हैं । यह लेख कृत्रिम abutments के लिए टाइटेनियम और सिरेमिक सामग्री पर मौखिक फिल्म के गठन की तुलना के लिए कार्यांवित प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला का वर्णन करता है, साथ ही साथ मौखिक में शामिल तरीके रूपात्मक और सेलुलर स्तर पर फिल्म विश्लेषण ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल कृत्रिम abutments के लिए टाइटेनियम और zirconia सामग्रियों पर, बैक्टीरियल कोशिका व्यवहार्यता और रूपात्मक विशेषताओं के विश्लेषण सहित, पर फिल्म निर्माण का मूल्यांकन करने के लिए विक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने अपनी उदार सहायता के लिए शिक्षा और SEM विश्लेषण और Preto Hermano Teixeira वीडियो संस्करण में अपने उदार तकनीकी सहायता के लिए सूक्ष्म Multiuser प्रयोगशाला (Ribeirão मचाडो की चिकित्सा के स्कूल) से जोस Augusto माउलीं धंयवाद ।
Materials
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors – X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
References
- Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
- Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
- Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections – an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
- Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
- Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
- Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J. Experimental peri-implant mucositis in man. Journal of Clinical Periodontology. 28 (6), 517-523 (2001).
- Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
- Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
- Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
- Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
- Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
- Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
- Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
- Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
- de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
- Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know?. Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055 (2016).
- Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
- do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness – an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
- Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms – An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
- Lakins, M. A., Marrison, J. L., O’Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two-photon excitation fluorescence microscopy. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 399-429 (2000).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , 11-24 (2013).
- Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
- Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
- Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
- Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
- Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
- Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
- Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
- Knutton, S. Electron microscopical methods in adhesion. Methods in Enzymology. 253, 145-158 (1995).
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
