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Medicine

Formazione di Biofilm orali su differenti materiali per impianti dentali

Published: June 24, 2018 doi: 10.3791/57756
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per la valutazione di biofilm orali su materiali di titanio e ossido di zirconio per i pilastri di protesi dentarie, compresa l'analisi di attuabilità delle cellule batteriche e caratteristiche morfologiche. Un modello in situ associato con tecniche di microscopia potente viene utilizzato per l'analisi di biofilm orale.

Abstract

Impianti dentali e loro componenti protesici sono inclini a colonizzazione batterica e la formazione di biofilm. L'utilizzo di materiali che fornisce bassa adesione microbica può ridurre la prevalenza e la progressione di malattie perimplantari. In considerazione l'ambiente orale complessità e oral biofilm eterogeneità, microscopia sono necessarie tecniche che consentono un'analisi di biofilm delle superfici dei denti e materiali dentali. Questo articolo descrive una serie di protocolli implementati per confrontare la formazione di biofilm orali su titanio e materiali ceramici per pilastri protesici, come pure i metodi coinvolti nelle analisi di biofilm orale a livello morfologico e cellulare. Il modello in situ per valutare la formazione di biofilm orali su materiali di titanio e ossido di zirconio per i pilastri di protesi dentale come descritto in questo studio fornisce una buona conservazione del biofilm 48h, dimostrando in tal modo adeguatezza metodologica. La microscopia multifotonica permette l'analisi di un rappresentante di zona del biofilm formato sui materiali di prova. Inoltre, l'uso di fluorofori e l'elaborazione delle immagini usando la microscopia multifotonica permette l'analisi della redditività batterica in una popolazione molto eterogenea di microrganismi. La preparazione di campioni biologici per microscopia elettronica promuove la conservazione strutturale del biofilm, immagini con una buona risoluzione e senza artefatti.

Introduction

Biofilm batterici sono complesse, funzionalmente e strutturalmente organizzato comunità microbiche, caratterizzato da una diversità di specie microbiche che sintetizzano un polimero extracellulare, biologicamente attivo matrix1,2. L'adesione batterica alle superfici di tipo biotiche o abiotiche è preceduto da una formazione della pellicola acquisita, costituita principalmente da glicoproteine salivari1,3,4. Deboli interazioni fisico-chimiche tra i microrganismi e la pellicola sono inizialmente stabilite e seguite da forti interazioni tra adesine batteriche e recettori glicoproteici della pellicola acquisita. Diversità microbica aumenta gradualmente attraverso la coaggregation dei colonizzatori secondarie ai recettori dei batteri già associate, formando una comunità multispecifica1,3,4, 5.

Omeostasi del microbiota orale e il suo rapporto simbiotico con l'host è importante nel mantenimento della salute orale. La disbiosi all'interno del biofilm orale possono aumentare il rischio per lo sviluppo di carie e malattia parodontale2,5. Gli studi clinici dimostrano una relazione di causa-effetto tra l'accumulo del biofilm su denti o impianti dentali e lo sviluppo di gengivite o peri-implantare mucosite6,7. La progressione del processo infiammatorio porta alla perimplantite e la conseguente perdita dell' impianto8.

Impianti dentali e loro componenti protesici sono inclini a colonizzazione batterica e la formazione di biofilm9. L'uso di materiali con una composizione chimica e la topografia di superficie che fornisce bassa adesione microbica può ridurre la prevalenza e la progressione di malattie perimplantari9,10. Il titanio è il materiale più utilizzato per la fabbricazione di pilastri protesici per protesi; Tuttavia, i materiali ceramici sono stati recentemente introdotti e stanno guadagnando popolarità come alternativa al titanio a causa della loro proprietà estetiche e biocompatibilità11,12. Inoltre importante, materiali ceramici sono stati associati con un potenziale presumibilmente ridotto ad aderire ai microrganismi, principalmente a causa di loro rugosità superficiale, bagnabilità ed energia libera di superficie10,13.

Studi in vitro hanno contribuito a progressi significativi nella comprensione dell'adesione microbica al moncone protesico superfici9,14,15,16,17. Tuttavia, l'ambiente dinamico della cavità orale, caratterizzata dalla sua temperatura variabile e il pH e la disponibilità di nutrienti, oltre che dalla presenza di forze di taglio, non è riproducibile in vitro protocolli sperimentali18, 19. Per ovviare a questo problema, un'alternativa è l'utilizzo di modelli in situ di formazione del biofilm, che vantaggiosamente conserva la sua struttura tridimensionale per ex vivo analisi10,20, 21 , 22 , 23 , 24.

L'analisi della complessa struttura del biofilm formata su substrati orale richiede l'utilizzo di tecniche di microscopia in grado di visualizzare otticamente densa materia25. Microscopia a scansione laser di Multiphoton è una moderna opzione per biofilm analisi strutturale26. È caratterizzato dall'uso di ottica non lineare con una fonte di illuminazione vicino alla lunghezza d'onda infrarossa, pulsato a femtosecondi27. Questo metodo è indicato per l'acquisizione di immagini di autofluorescence materiali o segnato da fluorofori, oltre alle immagini generate da segnali ottici non-lineari, derivati da un fenomeno noto come generazione di seconda armonica. Tra i vantaggi della microscopia multifotonica sono la profondità di grande immagine ottenuta con danno minimo delle cellule causato dall'intensità della luce di eccitazione27.

Per un'analisi di attuabilità del biofilm su superfici abiotiche da microscopia multifotonica, l'uso di acido nucleico fluorescente tinture con differenti caratteristiche spettrali e una capacità di penetrazione nelle cellule batteriche è richiesto28. Fluorophores SYTO9 (verde-fluorescente) e ioduro di propidio (rosso fluorescente) può essere utilizzati per una differenziazione visiva tra batteri vivi e morti28,29,30. Ioduro di propidio penetra soli batteri con membrane danneggiate, mentre SYTO9 entra nelle cellule batteriche con una membrana intatta e compromessa. Quando entrambi i coloranti sono presenti all'interno di una cella, ioduro di propidio sposta SYTO9, contrassegnandolo rosso28,30e ha una maggiore affinità per gli acidi nucleici.

In considerazione l'ambiente orale complessità e oral biofilm eterogeneità, microscopia sono necessarie tecniche che consentono l'analisi di biofilm delle superfici dei denti e materiali dentali. Questo articolo descrive una serie di protocolli implementati per confrontare la formazione di biofilm orali su titanio e materiali ceramici per pilastri protesici, come pure i metodi coinvolti nelle analisi di biofilm orale a livello morfologico e cellulare.

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Protocol

Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale della facoltà di odontoiatria di Ribeirão Preto, e il partecipante volontario firmato il consenso scritto (processo 2011.1.371.583).

1. di biofilm in Situ

  1. Selezione dei partecipanti
    1. Selezionare i pazienti sulla base dei seguenti criteri di inclusione: un individuo sano con una dentatura completa e nessun segni clinici delle malattie orali.
    2. Escludere i pazienti sulla base dei seguenti criteri di esclusione: gravidanza, allattamento, carie dentale, una malattia parodontale o trattamento antibiotico in ultimi 3 mesi, fumatore o qualsiasi malattia sistemica che poteva influenzare lo stato parodontale.
  2. Preparazione del dispositivo intraorale
    1. Registrare l'arco mascellare mediante un'impressione di alginato.
    2. Preparare tipo IV pietra aggiungendo 19 mL di acqua per 100 g di polvere di pietra. Versare la pietra nello stampo alginato per fare un modello dell'arco mascellare.
    3. Progettare e fabbricare un dispositivo intraoral acrilico per supportare i provini (dischi in ceramica e titanio).
      1. Fabbricare ritentive fermagli da filo NiCr (0,7 mm di diametro) utilizzando pinze ortodontiche #139 e la loro posizione sul modello. Per posizionare la pinza tra i molari superiori, piegare un'estremità di ogni filo in modo che formano un ciclo.
        1. Adattare il ciclo regione della papilla interdentale. Nella zona occlusale, inserire una delicata curvatura per non interferire con i punti di contatto e con l'occlusione. Rendere un 90° piega all'estremità del morsetto per una ritenzione in acrilico.
        2. Per montare il morsetto nel secondo molare superiore, adattare la curvatura del filo nel terzo cervicale (vestibolare) di contorno del dente (distale) e fare un 90° piegare all'estremità del morsetto per una ritenzione in acrilico.
          Nota: Al fine di fornire un'adeguata conservazione/stabilità al dispositivo intraorale, i ganci ritentivi sono stati posizionati tra i premolari superiori e funzione distale del secondo molare su entrambi i lati dell'arcata dentale.
      2. Manipolare la resina acrilica autopolimerizzante secondo le istruzioni del produttore e premere la resina acrilica tra 2 lastre di vetro (con un distanziatore di spessore di 3 mm interposto) durante la fase plastica, per fare un foglio di spessore di 3 mm.
      3. Stendere il foglio acrilico sulla regione palatale del modello, secondo il disegno del dispositivo e tagliare l'eccedenza della resina acrilica con un carver, prima della polimerizzazione.
      4. Fabbricare i dischi di cera utilizzando una matrice metallica [10 mm di diametro, 2 mm di spessore (superficie di 78,5 mm2)] posizionando la cera fusa nella matrice e aspettando la cera per solidificare. Manualmente è possibile incorporare 4 dischi di cera in resina acrilica, 2 di loro tra i premolari e gli altri 2 accanto ai secondi molari.
      5. Lasciare che la resina acrilica polimerizzare in una pentola a pressione sotto 20 psi di aria compressa per 20 min.
      6. Finire il dispositivo intraorale con un manipolo di laboratorio dentale elettrico e cutter e lucidare con gomma abrasiva.
      7. Regolare il dispositivo per una misura adeguata in bocca utilizzando le apparecchiature descritte sopra.
  3. Preparazione dei campioni di titanio e zirconio
    Nota: I campioni (n = 14) sono 10 mm di diametro e 2 mm di spessore e hanno una superficie di 78,5 mm2.
    1. Lucidare superfici degli esemplari con carte abrasive raffreddato ad acqua decrescente di abrasività (600, 1200 e 2000 grana), per circa 20 min.
      Nota: La lucidatura degli esemplari è stata effettuata per standardizzare la rugosità a 0,2 µm.
    2. Pulire e disinfettare i campioni e dispositivo intraorale con detersivo liquido e acqua di rubinetto e quindi utilizzare un bagno ad ultrasuoni di alcol isopropilico per 15 min. asciugarli con carta assorbente.
    3. Difficoltà gli esemplari nel dispositivo orale intraorale con circa 0,1 mL di adesivo non tossico hot melt (Figura 1).
    4. Installare il dispositivo contenente i campioni nella cavità orale.
      Nota: Il dispositivo intraorale contenente i campioni dovrebbe essere indossato per 48 h. Il dispositivo è stato rimosso e memorizzato in tampone fosfato salino (PBS), mentre il paziente era mangiare e l'esecuzione di pulizia orale.

2. valutazione di attuabilità batterica

Nota: Il campione dimensione n = 10.

  1. Preparare una soluzione di tintura con l'aggiunta di 3 µ l di SYTO9 (verde colorante fluorescente dell'acido nucleico) e 3 µ l di ioduro di propidio (tintura fluorescente rosso dell'acido nucleico) a 1 mL di sterile di acqua distillata.
    Nota: Preparare soluzioni al riparo dalla luce.
  2. Trasferire gli esemplari di una piastra a 24 pozzetti e lavarli accuratamente con PBS per rimuovere eventuali cellule non aderenti.
  3. Aggiungere il volume appropriato (1 mL) di soluzione colorante fluorescente per coprire il campione contenente biofilm. Aggiungere il colorante con molta attenzione per non disorganizzare il biofilm.
  4. Incubare il campione per 20-30 min a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
  5. Lavare delicatamente il campione di biofilm con acqua distillata sterile per rimuovere qualsiasi colorante in eccesso.
  6. Mettere il preparato in un piatto fondo di vetro ed eseguire laser di multiphoton microscopia per l'analisi di biofilm.
    Nota: L'analisi della redditività delle cellule batteriche è stato effettuato utilizzando un sistema di microscopia multifotonica. La fluorescenza di ioduro di propidio è stata rilevata utilizzando un filtro con una lunghezza d'onda di eccitazione/emissione di 546/680 nm e 477/600 nm per SYTO9. La dimensione delle immagini ottenute è stata 5.16188 x 5.16188 mm, che corrisponde al 26,64 mm2 di superficie totale di ogni campione (78,5 mm2) o 33.94% dell'area totale. Le immagini sono state fatte dalla parte più centrale del campione, con una risoluzione di 1.024 x 1.024 pixel. Il canale rosso e canale verde immagini sono state analizzate separatamente utilizzando Fiji software31. Ogni cella è stata selezionata utilizzando uno strumento di selezione e l'intensità della fluorescenza è stata misurata attraverso la densità integrata dei pixel, sottraendo l'immagine di sfondo.

3. analisi della composizione chimica dei campioni di spettroscopia dispersiva di energia (EDS)

Nota: Il campione dimensione n = 3.

  1. Selezionare 3 esemplari di ogni materiale di prova gratuita di biofilm e valutare la composizione chimica in 2 aree diverse di ciascun campione utilizzando un microscopio elettronico a scansione accoppiato ad uno spettrometro a dispersione di energia, con una tensione di fascio di elettroni di 10 kV32.

4. morfologico del Biofilm batterico di microscopia elettronica a scansione

Nota: Il campione dimensione n = 1.

  1. Difficoltà il biofilm immergendo gli esemplari in glutaraldeide al 2,5%, diluito in tampone cacodilato 0.1 M sodio, pH 7.0-7.3, per 24 h.
  2. Lavare il campione in tampone PBS (pH = 7.6).
  3. Postfix il biofilm con tetrossido di osmio 1% per 1 h.
  4. Lavare il campione in tampone PBS (pH = 7.6).
  5. Disidratare i campioni di biofilm con cura, tenendoli immersi in aumento delle concentrazioni di soluzioni di etanolo (50%, 70%, 90%, 95% e 100%).
    Nota: Eseguire 3 scambi di etanolo ad una concentrazione di 100%. Il passo di disidratazione totale impiegano circa 2 ore.
  6. Trasferire gli esemplari al punto critico asciugacapelli e fare diverse sostituzioni con anidride carbonica (CO2) fino a quando gli esemplari sono asciutti.
  7. Rimuovere i campioni essiccati dall'apparecchio e montarli sui possessori di microscopio elettronico a scansione.
  8. Sputter-cappotto uno strato di 20 nm di oro sulla superficie del provino per 120 s.
  9. Inserire i dischi rivestito in oro nella camera di microscopio elettronico a scansione. Ottenere immagini da 5 diverse aree di ogni esemplare, a 20-30 kV sotto pressione variabile e a 650 X ingrandimento12.

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Representative Results

La densità di colonizzazione del biofilm dopo 48 h di crescita in situ è stata rappresentata in questo studio la percentuale dell'area colonizzata sui dischi rispetto alla superficie totale digitalizzata del campione usando microscopia multifotonica (titanio e zirconio 26.64 mm2). Figura 2 rappresenta la densità di colonizzazione batterica sulla superficie dei 3 materiali testati. Una maggiore densità del biofilm è stata osservata sulle superfici del cast e dei dischi di titanio lavorato di macchina (0,0292 µm2 e 0.0213 µm2, rispettivamente) rispetto ai dischi di zirconia (0.0099 µm2; p < 0,05; Test di Kruskal-Wallis, seguita da test di Dunn).

La figura 3 Mostra la vitalità delle cellule batteriche sulle superfici di zirconia (Figura 3A, 3A', e 3A "), lavorati titanio (Figura 3B, 3B', e 3B") e il cast titanio (Figura 3, 3 C' , e 3 C ") dischi. In questo protocollo, l'ioduro di propidio colorante acido nucleico penetra solo da batteri con una membrana danneggiata e, quindi, emette un segnale rosso fluorescente che è imparentato con le cellule morte. SYTO9 penetra le cellule batteriche con membrana intatta o compromessa ed emette un segnale fluorescente verde da microrganismi vivi. Vitalità cellulare batterica era simile fra i materiali di prova, con una predominanza di microrganismi vivi in tutti i gruppi (Figura 4). Proporzioni di cellule vive/morte erano 2.10 per zirconia, 1.95 per titanio lavorato e 1.63 per titanio fuso.

Crepe, scanalature o difetti di abrasione prodotti sulla superficie di tutti i materiali durante il processo di lucidatura e/o di lavorazione sono stati osservati, più chiaramente in lavorati e dischi di titanio il cast. Nei dischi di zirconia, più grandi zone sono state osservate con un'assenza di microrganismi; Inoltre sono stati osservati piccoli aggregati microbici polimorfici costituita principalmente da Cocchi, bacilli e batteri filamentosi (Figura 5A e 5A'). La presenza di cocchi e bacilli era sparsa sulle superfici dei dischi di titanio lavorato di macchina (figura 5B e 5B'). Cast titanio esemplari presentati di colonie di microrganismi coinvolti in una matrice con un aspetto di biofilm sulla superficie (Figura 5 e 5 C'). Meno materiale di matrice è stato osservato sulla superficie dei dischi zirconio rispetto al titanio lavorato e dischi di titanio fuso.

L'analisi EDS ha rivelato 70,83% di ossido di zirconio, 22,84% di ossigeno, 4,52% dell'ittrio e 1,57% di afnio nei dischi di zirconia; 95,16% di titanio, 3,99% di ossigeno e 0,85% di carbonio nei dischi di titanio fuso; e 89,86% di titanio, 7.53% di ossigeno e 2,61% di carbonio nei dischi di titanio lavorato di macchina (Figura 6).

Figure 1
Figura 1 : Il dispositivo intraorale per la in situ Studio. Ritentivi fermagli sono stati realizzati con filo di ferro battuto, e disco di test di titanio e ossido di zirconio (10 mm di diametro, spessore 2 mm) sono stati posizionati in modo casuale nelle regioni premolari e molari, parzialmente incorporate in auto-polimerizzazione della resina acrilica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Immagini di fluorescenza della densità delle cellule batteriche. Queste sono le immagini di fluorescenza di titanio di densità su zirconio (A), (B) lavorate la cellula batterica, e (C) il cast dischi di titanio dopo 48 h in situ. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 3
Figura 3 : L'attuabilità delle cellule di batteri aderito alle superfici. Questi pannelli mostrano che l'attuabilità delle cellule di batteri aderito alle superfici dei morti (A) e live cellule batteriche su ossido di zirconio, (B) morti e vivono le cellule batteriche su titanio lavorato di macchina e (C) morti e live cellule batteriche su titanio fuso dischi raffigurati da formazione immagine di fluorescenza. Cellule batteriche morto sono macchiate con ioduro di propidio (A', B', e C': segnale rosso fluorescente). Batteri vivi sono macchiati con SYTO9 (A ", B", e C ": segnale di fluorescenza verde). Pannelli A, Be C mostrano immagini di colore-fuse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : BoxPlot che rappresenta il biofilm vitalità sui materiali differenti della prova cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : La microscopia. Questi pannelli mostrano la microscopia elettronica a scansione di (A, A') zirconia, (B, B') lavorati con titanio, e (C, C') dischi di titanio con biofilm, in panoramica e primi piani Visualizzazioni, il cast dopo 48 h in situ . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : Un'analisi elementare di spettroscopia dispersiva di energia (EDS). Questi pannelli mostrano i dischi (A) biossido di zirconio (Zr = ossido di zirconio, Y = ittrio, C = carbonio, O = ossigeno e Hf = afnio); (B) lavorazione titanio, e (C) il cast dischi di titanio (Ti = titanio, O = ossigeno e C = carbonio). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il protocollo descritto in questo studio è stato sviluppato per valutare la formazione di biofilm su materiali di titanio e ossido di zirconio per pilastri protesici, compresa l'analisi di attuabilità delle cellule batteriche e caratteristiche morfologiche. Per ottenere questo risultato, è stato progettato un modello di in situ di formazione del biofilm, che consiste di un dispositivo intraorale in grado di ospitare campioni di prova materiali e tenerli esposta all'ambiente orale dinamico per 48 h. Il dispositivo è stato considerato comodo e facile da inserire, rimuovere e pulire dal volontario. Eppure, ha dimostrato scarso impatto sulla fonetica ed estetica, era semplice e a basso costo per fabbricare e ha permesso un facile recupero dei campioni senza rottura della struttura biofilm. Inoltre, il metodo ha permesso la conservazione di cellule batteriche e l'integrità della matrice extracellulare. Il contatto della lingua con i campioni e la perdita accidentale del disco durante l'esperimento sono limitazioni del modello proposto. Al fine di ridurre al minimo le limitazioni del metodo, il posizionamento dei dischi nel dispositivo intraorale era distribuito in modo casuale; Inoltre, i dischi sono stati fissati con adesivo hot melt non tossico, e nessuna perdita di campione è stato segnalato.

Dovuto l'alta eterogeneità delle specie batteriche che abitano l'ambiente orale, tecniche di microscopia potente sono necessari per l'analisi dei biofilm colonizzando le superfici dure. La microscopia multifotonica fornisce parecchi vantaggi sopra analisi di microscopia confocale o convenzionale, come un inerente tridimensionale ad alta risoluzione, un'eccitazione del vicino infrarosso per penetrazione ottica superiore, una riduzione di photobleaching e photodamage quando imaging di cellule vive e una capacità di fornire informazioni quantitative33,34. Questi vantaggi hanno origine attraverso l'eccitazione altamente localizzato del processo di assorbimento a due fotoni e il ridotto effetto di dispersione della luce negli esemplari. Pertanto, microscopia multifotonica consente imaging dei tessuti profondi, danno cellulare minimo e un'iniziazione di fotochimica ben localizzata34. Campionamento casuale e un numero rappresentativo di campi devono essere eletti per accurate analisi35,36. Il microscopia di esame del laser di multiphoton ha permesso l'analisi delle zone di 5161.88 x 5161.88 µm, corrispondente al 33.94% dell'area totale del provino. Microscopia confocale non era a causa dell'esigenza di un gran numero di campi per l'analisi rappresentativa e un lungo periodo di valutazione degli esemplari. Inoltre, il segnale di out-of-focus fondo limitato l'uso della microscopia a fluorescenza. Nonostante i vantaggi della microscopia multifotonica, solo poche applicazioni in campo microbiologico sono segnalati37,38,39. Fra loro è il suo uso come strumento di manipolazione; ad esempio, per ottenere l'ablazione localizzata, apoptosi/necrosi, candeggio o fotoattivazione di un volume ben definito di biofilm celle26. Un'altra applicazione di questo metodo è quello di valutare l'efficacia degli agenti antibatterici contro più biofilm componenti25,40,41.

In questo studio, la vitalità delle cellule batteriche aderite è stata valutata con le tinture fluorescenti dell'acido nucleico, che penetrano le cellule in funzione della loro integrità di membrana28. Fluorofori e propidio ioduro di SYTO9 sono stati usati per la differenziazione visiva tra batteri vivi e morti. Alcune limitazioni dell'uso di SYTO9 e propidio ioduro sono segnalati nella letteratura, come la difficoltà di SYTO9 a macchiare i batteri gram-negativi con una membrana intatta perché deve attraversare le due membrane cellulari presenti nella struttura30, 42. Così, le cellule vive possono essere sottovalutate macchiando combinato. Inoltre, quando SYTO9 non viene completamente sostituito con ioduro di propidio, è possibile osservare fluorescenza giallo invece di rosso in cellule batteriche30,42. Un'altra limitazione è la diminuzione del segnale SYTO9 nel tempo. È consigliabile che le analisi di microscopia sono eseguite entro 30 min dopo l'esposizione ai coloranti29,30. È necessario considerare la fluorescenza di fondo per calcolare l'intensità del segnale, poiché l'autofluorescenza del substrato e la presenza di colorante non associato può interferire con i risultati30. Tuttavia, poiché queste limitazioni sono ben segnalate, è possibile avere i campioni trattati entro il termine specificato, anche per quanto riguarda attentamente selezionate e sottrarre sfondo delle immagini con l'ausilio del software Fiji.

Alta irradiazione di vuoto e di elettroni durante la microscopia rappresentano condizioni avverse per campioni contenenti materiale biologico. Oltre alle proprietà non-conduttivo, il biofilm nel suo stato naturale è idratato, che interferisce con il sistema di generazione e rivelazione dell'elettrone, formando artefatti43. Pertanto, i campioni contenenti materiale biologico devono essere preparati al fine di garantire la conservazione della struttura e la conduzione dei loro elettroni43,44. Le fasi di protocollo che coinvolgono la fissazione, disidratazione, essiccamento e del rivestimento degli esemplari con materiale conduttivo sono stati sviluppati con particolare attenzione per le diluizioni e tempo. La fissazione del materiale biologico è stata effettuata con un'aldeide in un tampone cacodilato e la post-fissazione con tetrossido di osmio, al fine di preservare la struttura del biofilm aderito43,45,46. Disidratazione è stata realizzata con una serie crescente di concentrazioni di etanolo, l'acqua viene gradualmente sostituito dal solvente organico44. Essiccazione con una distorsione minima dell'architettura del biofilm è stata effettuata attraverso il punto critico con successive sostituzioni di liquido CO2 per la rimozione di etanolo, seguita da una conversione di CO2 in fase gassosa, una rimozione del liquido / interfaccia di gas e l'eliminazione della tensione superficiale del campione43,44,45,46. Per garantire la conducibilità degli elettroni, prevenire o ridurre i danni e l'immagine che i manufatti, gli esemplari sono stati rivestiti con uno strato di 10-20 nm di oro o oro/palladio. Inoltre, gli esemplari con un sottile strato di metallo di rivestimento può ridurre l'accumulo di carica elettrica all'interno di un esemplare, migliorare il contrasto e aumentare immagine risoluzione46.

Nonostante alcune limitazioni, il modello in situ descritto in questo studio era adeguato per la valutazione della formazione di biofilm orali su materiali titanio e zirconio, preservando il biofilm di 48 h. L'uso di fluorofori connesso con formazione immagine di microscopia multifotonica ha permesso l'analisi dell'attuabilità delle cellule batteriche in una popolazione molto eterogenea di microrganismi che colonizzano i materiali di prova. Le tecniche impiegate nella preparazione del biologico campioni promosso conservazione strutturale di biofilm e ha permesso l'acquisizione di immagini di alta qualità per la visualizzazione e caratterizzazione morfologica dei microrganismi colonizzatrici .

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano José Augusto Maulin dal laboratorio di microscopia Multiuser (scuola di medicina di Ribeirão Preto) per la sua generosa assistenza con EDS e SEM analisi e Hermano Teixeira Machado per la sua generosa assistenza tecnica nell'edizione dei video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogum 5 Zhermack Dental C302070
Durone IV Dentsply 17130500002
NiCr wire  Morelli 55.01.070
JET auto polymerizing acrylic Clássico
Dental wax  Clássico
Pressure pot  Essencedental
Sandpapers 600 grit NORTON T216
Sandpapers 1200 grit NORTON T401
Sandpapers 2000 grit NORTON T402
Metallographic Polishing Machine Arotec
Isopropyl alcohol SIGMA-ALDRICH W292907
Hot melt adhesive TECSIL PAH M20017
Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit Invitrogen L10316
Pipette Tips, 10 µL KASVI K8-10  
Pipette Tips, 1,000 µL KASVI K8-1000B  
24-well plate  KASVI K12-024
Glass Bottom Dish Thermo Scientific 150680
AxioObserver inverted microscope  ZEISS
Chameleon vision ii laser Coherent
Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC ZEISS 440452-9903-000
SDD sensors - X-Max 20mm² Oxford Instruments
Glutaraldehyde solution SIGMA-ALDRICH G5882
Sodium cacodylate Buffer  SIGMA-ALDRICH 97068 
Osmium tetroxide SIGMA-ALDRICH 201030
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH S9638 Used for preparation of phosphate buffered saline
KH2PO4 SIGMA-ALDRICH P9791 
NaCl MERK 1.06404
Kcl SIGMA-ALDRICH P9333 
Ethanol absolute for analysis EMSURE MERK 1.00983
CPD 030 Critical Point Dryer BAL-TEC
JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope JEOL
SCD 050 Sputter Coater BAL-TEC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Silva, T. S. O., Freitas, A. R., Pinheiro, M. L. L., do Nascimento, C., Watanabe, E., Albuquerque, R. F. Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants. J. Vis. Exp. (136), e57756, doi:10.3791/57756 (2018).

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