Visualização da Microbiota nas entranhas do carrapato por toda a montagem In Situ da hibridação

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para espacial e temporalmente, avaliar a presença de microbiota viável nas entranhas de carrapato usando uma abordagem de hibridação in situ de montagem todo modificado.

Abstract

Doenças infecciosas transmitidas por vetores artrópodes continuam a ser uma ameaça significativa para a saúde humana em todo o mundo. Os patogénios causadores dessas doenças, não existem isoladamente quando colonizam o vetor; em vez disso, eles provavelmente se envolvem em interações com microorganismos residentes no lúmen do intestino. A microbiota do vetor tenha demonstrada que desempenham um papel importante na transmissão de patógeno para várias doenças transmitidas por vetores. Se bactérias residentes no intestino do carrapato Ixodes scapularis , o vetor de diversos patógenos humanos incluindo Borrelia burgdorferi, influenciam a transmissão de carrapato de patógenos não é determinado. Precisamos métodos para caracterizar a composição das bactérias associadas com o instinto de carrapato para facilitar uma melhor compreensão dos potenciais interações entre espécies no intestino carrapato. Usando toda a montagem em situ hibridização Visualizar transcritos de RNA associados a determinada espécie bacteriana permite a recolha de dados qualitativos sobre a abundância e a distribuição da microbiota no tecido intacto. Esta técnica pode ser usada para examinar as mudanças no meio de microbiota do intestino ao longo da escala de alimentação e também pode ser aplicada para analisar a expressão de genes de carrapato. Coloração de carrapato todo coragem rendimento informações sobre a distribuição espacial bruta do alvo do RNA no tecido sem a necessidade de reconstrução tridimensional e é menos afetada pela contaminação ambiental, que muitas vezes confunde o sequenciamento baseado métodos frequentemente utilizados para o estudo de comunidades microbianas complexas. Em geral, esta técnica é uma ferramenta valiosa que pode ser usado para melhor compreender a microbiota-vetor-patógeno interações e seu papel na transmissão da doença.

Introduction

Humanos e gado patógenos transmitidos por artrópodes são encontrados em todo o mundo e representam cerca de 20% das doenças infecciosas globalmente¹, mas eficaz e seguras vacinas contra a maioria desses patógenos não estão disponíveis. Nossa compreensão do importante papel dos microorganismos comensais, simbióticos e patogénicos, conhecidos coletivamente como o microbiome², na modulação e moldar a saúde de quase todos os metazoários³ está se expandindo. Agora é evidente que os artrópodes vetores de patógenos também abrigam a microbiota do intestino e estes microbiota associada vetor foram mostrados para influenciar diversos patógenos vetor^4,5. O artrópodes microbiome é composto de eubacteria, archaea, vírus e micróbios eucariontes como protozoários, nematoides e fungos⁶. No entanto, o foco de investigação predominante tem sido em eubacteria devido, em parte, à existência de genes marcadores e bancos de dados de referência para identificar membros bacterianos específicos.

Com foco em Ixodes scapularis, o vetor de escala de vários patógenos humanos incluindo Borrelia burgdorferi⁷, o agente causador da doença de Lyme, a otimização de uma técnica de visualização microbiana visava melhorar a nossa compreensão da microbiota do intestino carrapato no contexto das interações de vetor-patógeno. Várias questões permanecem para ser respondida no campo microbiome carrapato. O intestino é o local do primeiro encontro estendido entre o carrapato e o patógeno recebido no contexto de patógenos transferidos horizontalmente; Portanto, compreender o papel da microbiota do intestino vector em modulação interações vetor-patógeno irá revelar ideias significativas. Carrapatos têm um modo exclusivo de digestão da refeição de sangue, onde o processamento de farinha de sangue componentes leva intracelular Coloque⁸. O lúmen do intestino, aparentemente, serve como um recipiente para conter a refeição de sangue como os feeds de carrapato e assimilação e digestão de nutrientes ensue ao longo de vários dias de alimentação e continuam repletion pós. Os patógenos adquiridos pelo carrapato durante a alimentação entram o lúmen do intestino junto com a farinha de sangue e o lúmen torna-se assim um local principal de interações entre o carrapato, patógeno e microbiota residente. Como digestão prossegue através do repletion e carrapato Ixodid muda, o intestino sofre alterações estruturais e funcionais⁹. A composição e a organização espacial das bactérias do intestino também é susceptível de variar em concerto com o meio de intestino a mudança. É, portanto, importante compreender a arquitetura de bactérias residentes no intestino carrapato para compreender inteiramente a interação de carrapato, patógeno e microbiota do intestino.

Técnicas moleculares para descrever a microbiota associado anfitrião rotineiramente utilizam estratégias de sequenciamento paralelo elevado-throughput¹⁰ para amplificar e sequência de ADN ribossómico de 16S bacteriano (rDNA). Estas estratégias de sequenciamento contornar a necessidade de obter axénica culturas de bactérias específicas e fornecer uma descrição detalhada de todos os membros bacterianas representada na amostra. No entanto, tais estratégias são confundidas pela incapacidade de distinguir as contaminações ambientais de residentes de bona fide . Além disso, quando avaliar amostras, tais como carrapatos, que são pequenos em tamanho e, portanto, contenham baixa microbiota específica DNA produz, a probabilidade de amplificação dos contaminantes ambientais é o aumento de¹¹ e resulta na interpretação ambígua de Microbiome composição. Caracterização funcional em conjunto com a visualização de determinadas bactérias viáveis, portanto, será fundamental para definir e discernir a microbiome do tique-taque, temporalmente e espacialmente. Para atingir este objectivo, aproveitamos a toda a montagem do RNA em situ da hibridação. Esta técnica é usada rotineiramente para avaliar padrões de expressão de genes em embriões e órgãos^12,13,14 e permite análise semiquantitativa de expressão ao longo de toda a amostra de interesse. Isso difere do tradicional em situ hibridização as técnicas que utilizam cortes de tecido e muitas vezes exigem extensa análise do material seccionado com uma montagem computacional para prever a expressão em todo os órgãos¹⁵. Enquanto toda a montagem geralmente se refere a toda organismos¹², aqui toda a montagem refere-se a toda coragem ou órgãos. As vantagens de usar a conjunto de montagem do RNA em situ hibridização abordagem para avaliar a arquitetura da microbiota do intestino de carrapato são múltipla. O intestino do carrapato é composto de 7 pares de divertículos, cada par variando em tamanho¹⁶. As diferenças funcionais, se algum, entre esses divertículos, não são compreendidas no contexto da biologia de carrapato, assinale a microbiota ou carrapato-patógeno interações. Manipulações do intestino que rompem os divertículos de intestino deslocaria a microbiota presente no lúmen do intestino ou os associados frouxamente o intestino e resultar em erros de interpretação da localização espacial da microbiota. Fluorescência-etiquetada do RNA em situ hibridização tem sido utilizada anteriormente para examinar o carrapato intestino transcrições¹⁷ fixação e abrindo divertículos de intestino individuais para garantir a hibridização da sonda e localizar b. burgdorferi transcrições secionando parafina toda carrapatos¹⁸. Ambas essas abordagens exigem manipulações dos tecidos carrapato antes da hibridização que afetaria a arquitetura de microbiota do intestino.

Neste relatório, descrevemos em detalhe o protocolo para examinar a escala viável gut microbiota usando toda a montagem em situ da hibridação (WMISH). O uso de toda a montagem do RNA em situ da hibridação permite um entendimento global da presença e abundância de bactérias do intestino específicas nas diferentes regiões do intestino e pode estimular novos insights sobre biologia de intestino carrapato no contexto da colonização do patógeno e transmissão. Além disso, a utilização de sondas de RNA dirigida contra RNA bacteriano específico permite a detecção de bactérias viáveis no intestino carrapato.

Protocol

1. elaboração de modelos de DNA Download a sequência de 16S rRNA específica para cada gêneros bacterianos do NCBI design e banco de dados de cadeia polimerase (PCR) compatível para a frente e reverter as primeiras demão que vão amplificar regiões específicas de gêneros (~ 200-250 pares de base long), conforme descrito anteriormente 19. também referir os código-fonte aberto bancos de dados SILVA20,21 e probeBase<sup c…

Representative Results

A medição e avaliação da qualidade das sondas RNA são essenciais antes de iniciar a coloração. In vitro a transcrição eficácia depende altamente a quantidade e a qualidade do modelo de DNA. Nós rotineiramente visualizado as sondas de RNA em um gel de formaldeído para verificar a pureza e a quantidade de sonda gerada pelas reações da transcrição. As sondas devem aparecer como bandas brilhantes, discretas (Figura 2). Espectrofotométric…

Discussion

Este é o primeiro uso de uma técnica de hibridização (WMISH) toda a montagem em situ para estudar a microbiota de um vetor de artrópodes de patógenos. Nosso protocolo foi adaptado de um usado para estudar o desenvolvimento em Drosophila e em embriões de rã^25,26. Toda a montagem do RNA em situ hibridização tem sido usada rotineiramente para localizar transcritos do gene espacialmente e temporalmente²⁷ e …

Materials

Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron	Amazon	03-110/47
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360
Digoxygenin-11-UTP	Roche	1209256910
dNTP	New England Biolabs	N0447S
DNAse I(RNAse-free)	New England Biolabs	M0303S
HiScribe SP6 RNA synthesis kit	New England Biolabs	E2070S
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England Biolabs	E2040S
Water, RNase-free, DEPC-treated	American Bioanalytical	AB02128-00500
EDTA, 0.5M, pH 8.0	American Bioanalytical	AB00502-01000
Formaldehyde, 37%	JT Baker	2106-01
Formamide	American Bioanalytical	AB00600-00500
EGTA	Sigma Aldrich	E-4378
DPBS, 10X	Gibco	14300-075
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379-25ML
Proteinase K	Sigma Aldrich	3115879001
Triethanolamine HCl	Sigma Aldrich	T1502-100G
Acetic anhydride	Sigma Aldrich	320102-100ML
Paraformaldehyde	ThermoScientific/Pierce	28906
SSC, 20X	American Bioanalytical	AB13156-01000
RNA from torula yeast	Sigma Aldrich	R3629-5G
Heparin, sodium salt	Sigma Aldrich	H3393-10KU
Denhardt's Solution, 50X	Sigma Aldrich	D2532-5ML
CHAPS hydrate	Sigma Aldrich	C3023-1G
RNase A	Sigma Aldrich	10109142001
RNase T1	ThermoScientific	EN0541
Maleic acid	Sigma Aldrich	M0375-100G
Blocking reagent	Sigma Aldrich	11096176001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments	Sigma Aldrich	11093274910
Levamisol hydrochloride	Sigma Aldrich	31742-250MG
Chromogenic substrate for alkaline phosphatase	Sigma Aldrich	11442074001
Bouin's solution	Sigma Aldrich	HT10132-1L
Hydrogen peroxide	Mallinkrodt Baker, Inc	2186-01
Single stranded RNA ladder	Ambion -Millenium	AM7151
#11 High-Carbon steel blades	C and A Scientific Premiere	#11-9411
Thermocycler	BioRad, CA	1851148
Spectrophotometer	ThermoScientific	NanoDrop 2000C
Orbital shaker	VWR	DS-500E Digital Orbital shaker
Shaking water bath	BELLCO Glass, Inc	Hot Shaker-7746-12110
Gel  documentation system	BioRad	Gel Doc XR+ Gel documentation system
Bright-field Microscope	Nikon	NikonSM2745T
Bright-field Microscope	Zeiss	AXIO Scope.A1
Dissection microscope	Zeiss	STEMI 2000-C
Light box	VWR	102097-658
PCR purification kit	Qiagen	28104
Image capture software	Zeiss	Zen lite
Image editing software	Adobe	Adobe Photoshop CS4 version 11.0
Image analysis software	National Institutes of Health	ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
Automation compatible instrumentation	Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).	Intavis, Biolane HT1.16v