ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעריך במרחב של חנותם הנוכחות של קיימא microbiota במעיים שנתות תוך שימוש בגישה שונה כולה-הר היברידיזציה.
Abstract
מחלות זיהומיות המועברת על ידי וקטורים arthropod ימשיכו להוות איום משמעותי על בריאות האדם ברחבי העולם. פתוגנים גרימת מחלות אלו, אינם קיימים בבידוד כאשר הם ליישב את הווקטור; במקום זאת, הם כנראה לעסוק אינטראקציות עם מיקרואורגניזמים תושב ב לומן מעיים. Microbiota וקטור הוכח כדי לשחק תפקיד חשוב בפתוגן שידור עבור מספר מחלות נישאות וקטור. בין אם תושב חיידקים בבטן של השניה Ixodes scapularis , הוקטור של מספר פתוגנים האנושי כולל Borrelia burgdorferi, להשפיע על השידור שנתות של פתוגנים לא נקבע. אנחנו דורשים שיטות עבור אפיון ההרכב של חיידקים הקשורים עם הבטן שנתות כדי להקל על הבנה טובה יותר של פוטנציאל אינטראקציות בין זנים בבטן שנתות. שימוש כולה-הר בחיי עיר הכלאה להמחיש תעתיקים RNA הקשורים למין מסוים חיידקי מאפשר האוסף של נתונים איכותיים לגבי שפע והפצה של microbiota בתוך הרקמה ללא פגע. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לבחון שינויים וחשש microbiota הבטן במהלך שנתות האכלה, ניתן להחיל גם לנתח את הביטוי של גנים שנתות. צביעה של כל שנתות אומץ התשואה מידע אודות התפלגות מרחבית ברוטו היעד RNA ברקמה ללא צורך שחזור תלת מימדי, מושפע פחות זיהום סביבתי, אשר לעיתים קרובות מבלבל את מבוסס על רצף שיטות שימוש תכוף ללמוד קהילות מיקרוביאלי מורכבים. בסך הכל, טכניקה זו היא כלי רב ערך שיכול לשמש טוב יותר להבין וקטור-פתוגן-microbiota אינטראקציות ותפקידם העברת מחלות.
Introduction
האדם ובעלי פתוגנים ששודרו על-ידי וקטורים arthropod מצויים ברחבי העולם בחשבון כ- 20% של מחלות זיהומיות ברחבי העולם1, אך יעיל ואני בטוח חיסונים נגד רוב פתוגנים אלה אינן זמינות. הבנתנו תפקידה החשוב של מיקרואורגניזמים commensal, סימביוזה, פתוגניים, המכונה באופן קולקטיבי microbiome2, להתכוונן בעיצוב הבריאות של metazoans כמעט כל3 מתרחבת. עכשיו זה ברור arthropod וקטורים של פתוגנים הנמל גם בטן microbiota microbiota הקשורות וקטור אלה הוכחו השפעה מגוונים פתוגנים בעקיצות וקטור4,5. Microbiome arthropod מורכב eubacteria, ארכאונים, וירוסים, חיידקים האיקריוטים כגון חד-תאיים, נמטודות פטריות6. עם זאת, מוקד מחקר השולט כבר ב eubacteria נובע, בין השאר, את הזמינות של סמן גנים ובסיסי התייחסות לזהות חברי חיידקי ספציפי.
עם דגש על Ixodes scapularis, וקטור שנתות של פתוגנים האנושי מרובים כולל Borrelia burgdorferi7, סוכן סיבתי של מחלת ליים, אופטימיזציה של טכניקה ויזואליזציה מיקרוביאלי היה מכוון שיפור ההבנה שלנו של microbiota בטן שנתות בהקשר של אינטראקציות פתוגן-וקטור. מספר שאלות נותרו להיענות בשדה microbiome שנתות. הוא האתר של המורחבת המפגש הראשון בין השניה את הפתוגן נכנסות בהקשר של פתוגנים המועברים אופקית; לכן, להבין את התפקיד של וקטור microbiota בטן ב להתכוונן פתוגן-וקטור אינטראקציות תחשוף תובנות משמעותיות. קרציות יש מצב ייחודי של עיכול ארוחת דם, עיבוד של ארוחת דם רכיבים לוקח המקום intracellularly8. לומן מעיים לכאורה משמש קיבול להכיל את ארוחת דם כמו ההזנות שנתות, והוא מזין עיכול והטמעה ensue לאורך מספר ימים של האכלה ולהמשיך כסיגנל שלאחר. פתוגנים שרכשה את תקתוק שהאכילה הזן לומן הבטן יחד עם bloodmeal והופך ובכך לומן אתר ראשי של אינטראקציות בין שנתות, הפתוגן, תושב microbiota. כמו עיכול ממשיך דרך כסיגנל שנתות Ixodid משיר, הבטן עובר שינויים מבניים ופונקציונליים9. את ההרכב ואת הארגון המרחבי של חיידקים במעיים סביר גם משתנים בתיאום עם הבטן משתנה הסביבה שבה התרחשה. חשוב, לכן להבין את הארכיטקטורה של תושב חיידקים בבטן שנתות כדי להבין באופן מלא את הגומלין של שנתות הפתוגן, הבטן microbiota.
טכניקות מולקולריות כדי לתאר microbiota מארח-הקשורים באופן שגרתי לנצל אסטרטגיות רצפי מקביל בתפוקה גבוהה10 כדי להגביר את רצף ה-DNA חיידקי מטוסי אף-16 30s ריבוזומלי (rDNA). אלה אסטרטגיות רצפי לעקוף את הצורך להשיג axenic תרביות של חיידקים מסוימים מספקים תיאור מעמיק של כל חברי חיידקי ייצג במדגם. למרות זאת, אסטרטגיות מעין אלו הם מבולבל על ידי חוסר היכולת להבחין בין הסביבה מציג מתושבים bona פיד ה . עוד יותר, כאשר הערכת במדגמים, כגון קרציות, הינם קטני מידות ומכילות ומכאן DNA ספציפיים microbiota נמוך התשואות, הסבירות של הגברה של מזהמים סביבתיים מוגברת11 ותוצאות של פרשנות חד משמעיים של ההרכב microbiome. אפיון פונקציונלי בשיתוף עם הפריט החזותי של חיידקים קיימא ספציפי, לכן, תהיה קריטית כדי להגדיר ולהבחין את microbiome של שנתות חנותם והמרגשים. לעבר המטרה הזו, אנחנו ניצלו את העובדה RNA כולה-הר בחיי עיר הכלאה. טכניקה זו משמשת באופן שגרתי כדי להעריך את ג’ין תבניות ביטוי איברים, העוברים12,13,14 ומאפשר ניתוח semiquantitative של הביטוי על המדגם בכל עניין. זה שונה מסורתי בחיי עיר טכניקות הכלאה אשר לנצל את מקטעי רקמת ולעיתים קרובות דורשים ניתוח מקיף של חומר משרטוטי עם אסיפה חישובית לחזות ביטוי איברים כל15. בעוד כולה-הר מתייחס בדרך כלל אורגניזמים כל12, כאן כולה-הר מתייחס כל אומץ או איברים. יתרונות השימוש כולה-הר RNA בחיי עיר הכלאה הגישה כדי להעריך את הארכיטקטורה של שנתות בטן microbiota הם multifold. הבטן שנתות מורכב 7 זוגות diverticula, כל זוג משתנה גודל16. ההבדלים פונקציונלי, אם בכלל, בין אלה diverticula, אינם מובנים בהקשר של שנתות ביולוגיה, לתקתק אינטראקציות microbiota או פתוגן-שנתות. המניפולציות של המעיים, זה קרע את diverticula בטן תחסיר microbiota נוכח לומן מעיים או אלה הקשורים באופן רופף הבטן ואת התוצאה פירוש מוטעה של לוקליזציה המרחבי של microbiota. התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית RNA בחיי עיר הכלאה יש כבר מנוצל קודם לבחון שנתות בטן תעתיקים17 על-ידי תיקון ופתיחה diverticula בטן בודדים כדי להבטיח בדיקה הכלאה וכדי להתאים לשפה burgdorferi דרב תעתיקים באמצעות חלוקתה פרפין-מוטבע כל קרציות18. שתי גישות אלה דורשים מניפולציות של הרקמות שנתות לפני הכלאה שישפיעו על הארכיטקטורה microbiota בטן.
בדו ח זה, נתאר בפירוט את פרוטוקול לבחון microbiota בטן שנתות קיימא באמצעות כולה-הר בחיי עיר הכלאה (WMISH). השימוש של ה-RNA הכלאה בחיי עיר כולה-הר מאפשר הבנה גלובלית של נוכחות ושפע של הבטן ספציפי חיידקים באזורים שונים של המעיים, עשויה לדרבן תובנות חדשות שנתות ביולוגיה בטן בהקשר של פתוגן קולוניזציה ושידור. עוד יותר, השימוש של הגששים RNA נגד RNA חיידקי ספציפי מאפשר זיהוי של קיימא חיידקים בבטן שנתות.
Protocol
Representative Results
Discussion
זהו השימוש הראשון טכניקה הכלאה (WMISH) כולה-הר בחיי עיר ללמוד את microbiota של וקטור arthropod של פתוגנים. פרוטוקול שלנו הותאם מאחד המשמשות ללימוד פיתוח בדרוזופילה וב -צפרדע עוברי25,26. RNA הכלאה בחיי עיר כולה-הר נעשה שימוש באופן שגרתי כדי להתאים לשפה ג’ין תעת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר מוסטפא Khokha, אוניברסיטת ייל, למתן את השימוש במשאבים המעבדה שלו. אנו מודים על מר מינג-ג’יאה-וו לסיוע טכני מעולה. EF הוא חוקר HHMI. עבודה זו נתמכה על ידי מתנה ג’ון Monsky ואת קרן המחקרים של מחלת ליים Monsky של ג’ניפר וייס.
Materials
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
References
- Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
- Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
- Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
- Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
- Grigor’eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
- Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
- Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
- Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
- Sonenshine, D. E. . Biology of ticks. , (1991).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
- Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
- Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase–an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
- Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
- Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
- Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
- Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
- Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).
