Den gigantiske ciliate, Stentor coeruleus, er et utmerket system å studere regenerasjon og sårtilheling. Vi presenterer prosedyrer for å etablere Stentor cellekulturer fra enkeltceller eller cellen fragmenter, inducing regenerering av skjæring celler, kjemisk inducing gjenfødelse membranellar band og oral apparater, bildebehandling og analyse for celle regenerering.
Cellene trenger for å kunne generere sine deler å gjenopprette fra eksterne forstyrrelser. Den encellede ciliate Stentor coeruleus er en utmerket modell organisme til å studere sårheling og påfølgende celle gjenfødelse. Stentor genomet ble tilgjengelig nylig, sammen med moderne molekylærbiologi metoder, for eksempel RNAi. Disse verktøyene gjør det mulig å studere én celle regenerering på molekylært nivå. Den første delen av protokollen dekker etablere Stentor cellekulturer fra enkeltceller eller cellen fragmenter, sammen med generelle retningslinjer for å opprettholde Stentor kulturer. Dyrking Stentor i store mengder tillater bruk av verdifulle verktøy som biokjemi, sekvensering og massespektrometri. Etterfølgende avsnittene protokollen dekker ulike tilnærminger til inducing fornyelse i Stentor. Manuelt klippe celler med et glass nål kan studere fornyelse av store celle deler, mens behandling av celler med sukrose eller urea kan studere fornyelse av spesifikke strukturer i den fremre delen av cellen. En metode for bildebehandling regenerating enkeltceller tilbys, sammen med en rubrikk for staging og analysere dynamikken i gjenfødelse. Hele prosessen med gjenfødelse er delt i tre faser. Ved å visualisere dynamikken i utviklingen av en populasjon av celler gjennom stadier, er heterogenitet i gjenfødelse timing demonstrert.
Celler er ikke enkel poser av enzymer, men ganske komplekse maskiner med komponenter er nøye skalert til riktig størrelse og arrangert i veldefinerte posisjoner. Morphogenesis for enkeltceller representerer en viktig prosess i cellen og utviklingsbiologi, men dens molekylær mekanikk er ukjent1,2. Mens noen kulturperler celler ligne blobs, kan encellede organismer ha svært komplisert arkitektur, eksemplifisert ved komplekse kortikale mønstrene sett i ciliates3,4.
Kanskje er det mest ekstreme eksempelet på en svært strukturerte celle Stentor coeruleus, en gigantisk heterotrichous ciliate fjernt beslektet til Tetrahymena og Paramecium. Stentor er 1 mm lang og er dekket med mer enn 100 langsgående striper av blå pigment alternerende med rader av flimmerhårene organisert av parallelle stabler av microtubule bånd som kjører lengden på hele cellen. Cellen er trompet-formet (figur 1), med membranellar band og et muntlig apparat (OA) på fremre enden og en holdfast som festes cellen til underlaget i den bakre enden. I tillegg til klart anterior-posterior polaritet viser cellen også en særegen chiral mønstre, slik at avstanden mellom ciliary gradvis økning i retning med klokken. Dette resulterer i en diskontinuitet hvor raden smaleste møter den bredeste raden, og denne regionen på celleoverflaten, kjent som locus stripe kontrast, kan indusere dannelsen av det andre settet av fremre delen strukturer når podet på en annen celle5, gjør det formelt tilsvarer Spemanns assistent. Dermed alle nøkkelprosesser i utviklingsbiologi har sine analogs i Stentor: axiation, mønster dannelse og induksjon. I et embryo, disse prosessene er drevet av skjebnen forskjeller mellom ulike celler, men i Stentor, de må bli drevet av skjebnen forskjellene mellom forskjellige områder i én celle. Hva definerer forskjellene mellom områdene i Stentor er et mysterium.
Hvis noen del av Stentor er kuttet av, kan den manglende brikken i cellen regenerere for å gi en normal celle i løpet av timer. Hvis en celle er kuttet i to eller inn i mye mindre biter, hver brikke omorganiserer i en normal-ser men mindre celle og gjenoppretter riktig forholdsmessighet mellom cellen deler6,7. Selv små fragmenter, 1/64th størrelsen på den opprinnelige cellen, kan regenerere i en liten, men normalt proporsjonert celle, og deretter vokser til full størrelse6. Stentor dermed presenterer en unik mulighet til å studere mekanismer for organelle størrelse skalering og celle vekst regulering med kirurgiske metoder som vanligvis brukes på vev eller hele organismer.
En av egenskapene til Stentor at den kan regenerere fra en rekke kirurgiske operasjoner er at den inneholder en enkel nodulated macronucleus (figur 1) med om lag 50.000 kopier av hele genomet8. Så lenge en celle fragment inneholder minst én macronuclear node, har den evnen å regenerere fullt. En annen egenskap underliggende Stentorgjenfødelse evne er uhyre sårhelende evnen. Selv om mange celletyper kan healing deres sår9, er Stentor kjøpedyktig komme seg fra et ekstraordinært utvalg av fysiske forstyrrelser. Et eksempel på Stentor utvinning fra en drastisk forstyrrelsene, sammen med metodene for å visualisere cytoplasmatiske flyt i Stentor10 tidligere rapportert. Disse metodene kan studere hvordan såret og påfølgende gjenfødelse påvirker den fysiske tilstanden på cytoplasma.
Stentorstor størrelse, ekstraordinære gjenfødelse evne og det faktum at det manifesterer mange utviklingsmessige fenomener i flercellet embryo (som arrangørene, axiation og mønstre) tiltrukket mange utviklingsmessige biologer under begynnelsen av forrige århundre, inkludert Thomas Hunt Morgan7. I løpet av 50 og 60-tallet demonstrerte Mikrokirurgiske tilnærminger en oppsiktsvekkende rekke regenererende og Morfogenetiske prosesser i denne encellet organisme11. Men har Stentor blitt utviklet som et molekylærbiologi modellsystem nylig. I løpet av de siste årene, genomet av Stentor ble sekvensert og samlet8, og metoden å forurolige genuttrykk bruker RNAi av fôring var utviklet12.
En av grunnene til at Stentor ble utviklet i en modell organisme for moderne molekylærbiologi bare nylig var vanskelighetene med voksende store kulturer på grunn av sin lange cellen syklus (3-5 dager). Men krever moderne genomic og proteomic metoder mindre materialer enn de pleide, og volumet av en enkeltcelle i Stentor er tilstrekkelig for disse metodene, selv uten resorting å ultrasensitive metoder som ble utviklet for analyse av én celler som er mye mindre enn Stentor. Del 1 av protokollen detaljer prosedyren for å etablere en stor kultur fra en enkeltcelle i Stentor . Samme tilnærming kan brukes til å etablere en stor kultur fra en celle fragment oppnådd ved å kutte en celle. Del 1 gir også retningslinjene for å opprettholde sunt Stentor kulturer over lengre tid. Del 2 av protokollen gir metodikken for inducing celle regenerering ved å kutte cellene manuelt med et glass nål. Del 3 av protokollen er dedikert til to metoder for å indusere fornyelse av bestemt celle strukturer (membranellar band og oral apparater): behandle cellene med sukrose eller urea fører til utgytelsen av disse strukturene, etterfulgt av deres regenerering. Del 4 av protokollen detaljer en metode for avbilding av regenererende enkeltceller over lengre tid. Del 4 ender med en beskrivelse av stadiene av gjenfødelse og tips om analyse av gjenfødelse dynamics.
Dyrking Stentor presenterer en rekke utfordringer. Først for å utføre eksperimenter som krever stort antall celler, trenger man å opprettholde et stort antall Stentor kulturer, som kulturer blir usunn når Stentor konsentrasjon overstiger 20 celler/mL. Andre organismer som kan forurense Stentor kulturer ofte dele raskere enn Stentor og overvelde kultur (en vanlig miljøgifter er Wrotek). Derfor er det nødvendig å inspisere kulturen under et mikroskop med jevne mellomrom og fjerne forurensninger. Noen ganger må en ny kultur startes fra et lite antall celler reddet manuelt fra en forurenset kultur. Dette øker tiden det tar å opprettholde sunn Stentor kulturer. Tredje krever utvide en enkeltcelle i en 400 mL kultur minst en måned fordi Stentor celle syklus er 3-5 dager. Fjerde, i motsetning til andre modellen ciliates, Stentor sjelden gå inn cyste skjemaet og de kan ikke bli frosset.
En viktig del av dyrking Stentor er valg av en riktig mat organisme. Ulike metoder for dyrking Stentor ble beskrevet tidligere. En av dem foreslår for å bruke skummet melk til kultur bakterier som mater Stentor. Slike en teknikk er effektive i dyrking Stentor; Imidlertid krever bruk av genomisk teknikker ren prøver å unngå forvirring fra genomisk leser fra udefinert mat organismer. Bruker gjeldende protokollen, Stentor kan dyrkes i massen og fordi maten, Chlamydomonas, har blitt sekvensert, tilstedeværelse av genomisk forurensning fra mat organismen kan oppdages og kontrollert. For ukjente årsaker måtte Tartar fylle hans aksjer ved å returnere til hvor han fant Stentor før. Med gjeldende protokollen, har vi kunnet holde Stentor i år.
Gjenfødelse eksperimenter med Stentor er generelt grei, men det er noen viktige detaljer å tenke. I forhold til del 2, kutte Stentor celler i halvparten kan være mestret i minutter. Mastering mer avanserte mikrokirurgi prosedyrer for Stentor kan kreve en uke med trening. Mens utfører en sukrose eller urea behandling (del 3), hvis i begynnelsen av imaging de fleste cellene fremdeles har sine membranellar band, øke inkubasjon tid ved 10-30 s når sukrose behandling utføres neste. Ikke Øk av sukrose behandling utover 3 min incubation fordi det vil resultere i celledød.
Imaging av Stentor krever gjenfødelse metoder å bilde store celler over lengre tid. Tenkelig metoden beskrevet i punkt 4 kan bare brukes med en oppreist mikroskop. Hvis en invertert mikroskopet er tilgjengelig i stedet, kan deretter celler plasseres på et lysbilde eller dekkglassvæske i små rom. En metode er å skape et kammer av vaselin og dekk med en annen dekkglassvæske å hindre fordampning. Eventuelt et kammer for enkeltceller kan gjøres ved å lage et hull med et hull av ønsket størrelse i en 1 x 1 cm-2 for silisium spacer (tabell for materiale), plassere mellomlegget på en dekkglassvæske, legger celler i kammeret , og dekker kammer med en annen dekkglassvæske. Når imaging, hvis Stentor ikke er i riktig retning å observere de karakteristiske trekk ved hvert trinn i gjenfødelse, trykk platen fast for å gjøre cellen kontrakten. Se cellen utvide for å identifisere fasen av gjenfødelse (full forlengelse tar ca 45 s). Hvis cellen er i feil retning, gjenta å peke. Bildene som vises i figur 1 og figur 6 ble tatt av stereo zoom mikroskop; men kan alle eksperimentene detaljert utføres med en 5 X dissekere stereo mikroskop.
En annen utfordring foruten dyrking og imaging Stentor er sporing av gjenfødelse, spesielt hvor mye tid er nødvendig for å identifisere stadier. Hvis regenerating cellen er orientert med regionen i den muntlige primordium synlig, tar identifikasjon av scenen noen sekunder. Noen ganger, men er Stentor cellen i en retning hindre klar tildeling av gjenfødelse scenen, dermed tar mer tid å identifisere. Den betydelige mengden tid å stage enkeltceller regenerating kan forsinke kvantifisering av alle regenerating celler, dermed redusere timelige presisjonen for staging og krever observatøren vente og re-image cellen etter at den er flyttet til en ny retning. Derfor er dette eksperimentet både tid og arbeidsintensiv. For disse grunner, ville det være svært ønskelig å utvikle automatiserte metoder for å oppdage Stentor celler og tilordne stadier av gjenfødelse video mikroskopi data. Dette vil også gi rom for mer reproduserbar eksperimenter, øker utvalgsstørrelsen og fjerning av menneskelig bias.
Fremveksten av svært følsom genomic og proteomic metoder har begynt å sette studier av enkeltceller til nå. For slike encellede analyser gjør gigantiske størrelsen på en Stentor celle det en ønskelig test emne for proof-of-concept eksperimenter. For slike eksperimenter å være mulig, dyrking Stentor grunnleggende og så metodene som er beskrevet her bør spille en rolle i videre utvikling av mer avanserte encellede teknikker.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH grant R01 GM113602 (WFM) og NSF 1144247 (AL). Vi anerkjenner Mark Slabodnick og Natalie Kirkland for å utvikle de første versjonene av noen av disse protokollene og informativ diskusjoner. Vi takker Karina Perlaza og Greyson Lewis for kritisk lesning av manuskriptet.
Stentor coeruleus live culture | Carolina Biological Supply | 131598 | |
Chlamydomonas reinhardtii on agar | Carolina Biological Supply | 152040 | |
Pasteurized springwater, 1-quart bottle | Carolina Biological Supply | 132458 | |
Methyl cellulose, 1500 cP | Millipore Sigma | M0387 | |
Pyrex glass spot plate | Fisher Scientific | 13748B | |
Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL | Carolina Biological Supply | 715740 | |
2-cup glass container with glass lid | Pyrex | 1095600 | |
CultureWell silicone sheet material | Grace Bio Labs | 664475 | |
Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | |
Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
Cover Glass | Fisher finest | 12-548-B | |
TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture | ThermoFisher | A1379801 | |
Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio Labs | 664475 | |
Petrolatum, Petroleum Jelly, White | Spectrum | P1037 | |
Borosilicate glass capillary tubes. OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm. |
Sutter Instrument | B120-90-10 | |
Needle puller P-87 | Sutter Instrument | ||
Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | ||
Axiozoom V16, stereo zoom microscope | Zeiss |