मानचित्रण चयापचय: निगरानी स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि सीधे ऊतक में
Summary
हम एंजाइमों कि nicotinatmide adenine dinucleotide फॉस्फेट (णड (पी) एच) उत्पंन एंजाइमी गतिविधि के स्थानिक वितरण मानचित्रण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन + एच + सीधे ऊतक के नमूनों में ।
Abstract
मानचित्रण अंतरिक्ष और समय में एंजाइमी गतिविधि सामांय ऊतक और रोग में कोशिका व्यवहार के आणविक आधार को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । सीटू चयापचय गतिविधि परख में एक ऊतक के भीतर चयापचय गतिविधि के स्थानिक वितरण के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं । हम यहां एंजाइम स्तनपान डिहाइड्रोजनेज की गतिविधि की निगरानी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल सीधे ऊतक नमूनों में प्रदान करते हैं । स्तनपान डिहाइड्रोजनेज कि भस्म ग्लूकोज एरोबिक या anaerobic glycolysis के माध्यम से ऊर्जा के लिए परिवर्तित हो जाएगा का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है । स्तनपान और णड युक्त एक समाधान एक जमे हुए ऊतक अनुभाग के लिए प्रदान की जाती है । उच्च स्तनपान कराने वाली डिहाइड्रोजनेज गतिविधि के साथ कोशिकाओं को प्रदान की स्तनपान पाइरूवेट में परिवर्तित कर दिया जाएगा, जबकि साथ ही परिवर्तित nicotinamide adenine dinucleotide (णड) नध और एक प्रोटॉन, जो की कमी के आधार पर पता लगाया जा सकता है प्रदान की nitrotetrazolium नीले formazan के लिए, जो एक नीली हाला के रूप में visualized है । हम माउस त्वचा में स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि की निगरानी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल को लागू करने, हमने पाया है कि स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि त्वचा के भीतर quiescent बाल कूप स्टेम कोशिकाओं में उच्च है । संस्कृतिक माउस को प्रोटोकॉल लागू भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से पता चला उच्च संस्कृति वाले भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में धुंधला माउस भ्रूण fibroblasts से । ताजा पृथक माउस का विश्लेषण महाधमनी महाधमनी करने के लिए सीधा चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में दाग का पता चला । प्रदान की पद्धति के लिए स्थानिक एंजाइमों कि जमे हुए या ताजा ऊतक में एक प्रोटॉन उत्पंन की गतिविधि नक्शा इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
ऊतकों जिसमें एंजाइमों उच्च या कम गतिविधि है के भीतर स्थानों को समझना विकास और फिजियोलॉजी को समझने के लिए आवश्यक है । प्रतिलिपि या प्रोटीन के स्तर अक्सर एंजाइमी गतिविधि के लिए किराए के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं । हालांकि इस तरह के अध्ययन जानकारीपूर्ण जा सकता है, वे जानकारी है कि एक एंजाइम की गतिविधि, जैसे कि पोस्ट-शोधों के संशोधन के रूप में निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है प्रदान नहीं करते हैं, प्रोटीन परिसरों की उपस्थिति, या एंजाइम के उपसेलुलर स्थानीयकरण. जब एंजाइमी गतिविधि सीधे मापा जाता है, यह अक्सर homogenized प्रोटीन lysates में नजर रखी है कि अब मिश्रण या एक ऊतक के भीतर उच्च या कम गतिविधि के साथ कोशिकाओं के स्थानिक वितरण के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं के बारे में जानकारी शामिल है ।
हम यहां एक ऊतक नमूने के भीतर एंजाइमी गतिविधि के स्थानिक वितरण मानचित्रण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस पद्धति के पहले के अध्ययनों पर आधारित है कि tetrazolium लवण dehydrogenases, reductases, और जमे हुए ऊतक1में oxidases की गतिविधि स्थानीयकरण किया जा सकता है प्रदर्शन । इन तरीकों के साथ, एक पानी अघुलनशील formazan जब प्रोटान एक tetrazolium नमक2,3को हस्तांतरित कर रहे है बनते हैं । ग्लूकोज-6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज NADPH और एक प्रोटॉन उत्पन्न करता है, और tetrazolium गतिविधि के साथ पाया गया है. ग्लूकोज-6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज में यूरोपीय अशुद्धि हेपैटोसाइट्स4में निगरानी की गई है, वायुकोशीय टाइप 2 कोशिकाओं में फेफड़ों की5 और बिगडते की किडनी5. Tetrazolium लवण भी जमे हुए ऊतक6में transketolase गतिविधि पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इसी तरह के एक दृष्टिकोण हाल ही में आसंन स्लाइड7पर एक ही ऊतक में एकाधिक dehydrogenases की गतिविधि पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
हम यहां एक विधि का वर्णन करने के लिए tetrazolium लवण का उपयोग करने के लिए स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि के स्थानिक वितरण की निगरानी (चित्रा 1) । स्तनपान डिहाइड्रोजनेज पाइरूवेट परिवर्तित कर सकते है glycolysis द्वारा उत्पंन करने के लिए स्तनपान, और रिवर्स प्रतिक्रिया । स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि के फलस्वरूप tricarboxylic एसिड चक्र में पाइरूवेट के प्रवेश द्वार के एक महत्वपूर्ण निर्धारक के रूप में अपने स्राव बनाम स्तनपान के रूप में है । रक्त में स्तनपान का स्तर अक्सर कैंसर8,9,10सहित रोगों की एक सीमा का निदान करने के लिए उपयोग किया जाता है, क्योंकि यह संकेत कर सकते हैं कि बीमारी या चोट क्षतिग्रस्त कोशिकाओं है और एंजाइम जारी किया गया है ।
वहां चार स्तनपान डिहाइड्रोजनेज जीन हैं: LDHA, LDHB, LDHC, और LDHD11। LDHA और LDHB के लिए एक प्रारंभिक LDHA जीन12के दोहराव से पैदा हुआ है लगा रहे हैं । LDH एक tetramer और LDHA के रूप में सक्रिय है और LDHB एक दूसरे के साथ homotetramers और heterotetramers फार्म कर सकते हैं । LDHA पाइरूवेट के लिए उच्च संबंध है की सूचना दी है, जबकि LDHB स्तनपान के लिए उच्च समानता है की सूचना दी है, और तरजीही को13पाइरूवेट को स्तनपान में परिवर्तित । LDHA प्रवर्तक HIF1α, cMYC और FOXM1 प्रतिलेखन कारकों11के लिए बाध्यकारी साइटों में शामिल हैं । इसके अलावा, कई अन्य glycolytic एंजाइमों की तरह14,15, LDH पोस्ट-शोधों संशोधनों के द्वारा संशोधित किया जा सकता है. Fibroblast वृद्धि कारक रिसेप्टर 1 Y10 पर LDHA phosphorylate कर सकते हैं, जो tetramer गठन को बढ़ावा देता है, या Y83, जो नध सब्सट्रेट बंधन16को बढ़ावा देता है. LDHA17acetylated भी किया जा सकता है । इन कारणों के लिए, LDH गतिविधि की एक पूरी समझ न केवल LDH प्रोटीन के स्तर की निगरानी की आवश्यकता है, लेकिन है एंजाइम गतिविधि के रूप में अच्छी तरह से ।
विधि हम यहां मौजूद के अलावा, अंय दृष्टिकोण को स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है । स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि homogenized प्रोटीन lysate में spectrophotometrically निगरानी की जा सकती है । स्तनपान कराने वाली नध के रूप में पाइरूवेट में परिवर्तित की जाने वाली पीढ़ी को ३४० एनएम पर सोखने के आधार पर मापा जा सकता है, जबकि नध के लापता होने पर नजर रखी जा सकती है पाइरूवेट के रूप में स्तनपान१८में परिवर्तित हो जाता है. स्तनपान कराने की डिहाइड्रोजनेज गतिविधि भी चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के साथ नजर रखी गई है । 13 सी-पाइरूवेट प्रशासित किया जा सकता है और स्तनपान कराने के लिए पाइरूवेट के रूपांतरण के अनुपात के रूप में निगरानी की जा सकती है [1-13ग] स्तनपान कराने की/[1-13ग] पाइरूवेट । [1-13ग] स्तनपान का ऊंचा अनुपात/[1-13सी] पाइरूवेट कैंसर ऊतक19में मनाया गया है । जबकि एमआरआई-आधारित दृष्टिकोण सामांय और रोग के ऊतकों में स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं, के तरीके में विशिष्ट कोशिकाओं में गतिविधि स्तर निर्धारित करने के लिए संकल्प की जरूरत नहीं है । यहां प्रदान की पद्धति ऊतक क्षेत्रों में और यहां तक कि एकल कोशिकाओं में स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं ।
सीटू गतिविधि की परख में प्रयोग, हमने पाया है कि स्तनपान डिहाइड्रोजनेज की गतिविधि बाल कूप में उच्च है माउस त्वचा20के स्टेम कोशिकाओं । हम यह भी विधि का उपयोग करने के लिए डिहाइड्रोजनेज की गतिविधि पर नजर रखने के लिए प्रसंस्कृत भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में और पाया गतिविधि स्टेम सेल में फीडर परत से अधिक है । अंत में, हम ताजा माउस महाधमनी में स्तनपान डिहाइड्रोजनेज की गतिविधि पर नजर रखी और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में दाग मनाया । हम यहां जमे हुए माउस त्वचा में स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि की निगरानी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
विधि यहां वर्णित स्तनपान डिहाइड्रोजनेज या अंय चयापचय एंजाइमों की गतिविधि पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि नध या NADPH, एक ऊतक के भीतर विभिंन प्रकार के कक्ष में या समय के साथ एक ऊतक के विभिंन भा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC रीता एलेन फाउंडेशन (http://www.ritaallenfoundation.org) के मिल्टन ई. Cassel विद्वान थे । यह काम जनरल मेडिकल साइंसेज R01 GM081686, R01 AR070245, राष्ट्रीय जनरल मेडिकल साइंसेज R01 GM0866465, एली और Edythe व्यापक अपक्षयी चिकित्सा और स्टेम सेल रिसर्च के केंद्र के राष्ट्रीय संस्थान से HAC को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया ( गुलाब हिल्स और एचएएल गाबा पुरस्कार), आईरिस खिचड़ी भाषा महिला स्वास्थ्य केंद्र/UCLA CTSI NIH अनुदान UL1TR000124, ल्यूकेमिया लिंफोमा सोसायटी, प्रभाव पुरस्कार Jonsson व्यापक कैंसर केंद्र से WEL और HAC के लिए । इस प्रकाशन में दी गई अनुसंधान सूचना राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के पुरस्कार संख्या P50CA092131 के अंतर्गत समर्थित किया गया. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी । HAC एली और Edythe व्यापक अपक्षयी चिकित्सा और स्टेम सेल अनुसंधान के केंद्र के एक सदस्य है, ucla आणविक जीवविज्ञान संस्थान, और ucla Bioinformatics विभागीय कार्यक्रम ।
Materials
| Surgical instruments | For collecting skin from euthanized mice | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | For freezing mouse skin |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Fisher Scientific | NC9638938 | For mounting cryomolds |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| Dry Ice | |||
| Polysine Adhesion Slide | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% formalin | Fisher Scientific | 23-245-684 | Dilluted in water |
| phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| vortex | |||
| Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Phenazine methosulfate | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Nitrotetrazolium blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Lithium L-lactate | Sigma-Aldrich | L2250 | Substrate |
| 37°C incubator (or tissue culture incubator) | |||
| Braziliant! Counter stain | Anatech | 861 | Counter stain |
| Mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| Cover slips for slides | Fisher Scientific | 12-544D | |
| Light microscope |
References
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