Optimering af Laser-Capture Microdissection til isolering af entero ganglier fra frisk frosset menneskeligt væv
Summary
Målet med denne protokol er at få høj-integritet RNA prøver fra enterisk ganglier isoleret fra ikke optagne, frisk resektion menneskelige tarmens væv ved hjælp af laser fange microdissection (LCM). Denne protokol omfatter flash-frosset prøver af menneskelige tarmens væv, cryosectioning, ethanoliske farvning og dehydrering, LCM, og RNA udvinding.
Abstract
Formålet med denne metode er at få høj-integritet RNA prøver fra enterisk ganglier indsamlet fra optagne, frisk resektion menneskelige tarmens væv ved hjælp af laser fange microdissection (LCM). Vi har identificeret fem trin i arbejdsgangen, der er afgørende for at opnå RNA isolater fra enterisk ganglier med tilstrækkelig høj kvalitet og kvantitet for RNA-FF. Først, når du forbereder tarmens væv, hver prøve skal alle overskydende væske fjernes ved blotting før udfladning serosa så meget som muligt på tværs i bunden af store base forme. Prøverne er derefter hurtigt frosset på toppen af en opslemning af tøris og 2-methylbutane. For det andet ved skæring af væv, er det vigtigt at placere cryomolds, så tarm afsnit parallelle fuld flyet af den myenteric plexus, hvilket giver den største areal på enteriske ganglier pr. slide. Tredje, under LCM, polyethylen napthalate (PEN)-membran dias tilbyder den største hastighed og fleksibilitet i skitserer uensartet figurer af entero ganglier, når du indsamler enterisk ganglier. For det fjerde for særskilte visualisering af entero ganglier i sektioner tilbyder ethanol-kompatible farvestoffer, som Cresyl Violet, fremragende bevarelse af RNA integritet i forhold til vandige farvestoffer. Endelig, for udvinding af RNA fra erobrede ganglier, vi observerede forskelle mellem kommercielle RNA udvinding kits, der gav superior RNA mængde og kvalitet, samtidig fjerne DNA forurening. Optimering af disse faktorer i den nuværende protokol væsentligt accelererer arbejdsprocessen og udbytter enterisk ganglier prøver med ekstraordinære RNA kvalitet og kvantitet.
Introduction
Denne metode er designet til at opnå høj kvalitet RNA prøver af entero ganglier fra menneskelige tarmens væv ved hjælp af laser fange microdissection (LCM). Protokollen beskrevet her er blevet optimeret til at give tilstrækkelig RNA kvalitet og udbyttet for RNA sekventering (RNA-seq) og er beregnet til brug med frisk resektion, optagne, flash-frosset menneskelige tarmens væv.
Funktionelle mave og gut motilitetsforstyrrelser påvirker én af hver fire mennesker i USA. Det enteriske nervesystem (ENS), også kaldet den anden hjerne1, er ofte i midten af disse lidelser, der spiller en afgørende rolle i gut homøostase og motilitet. Manipulation af gut motilitet har generelt været begrænset til kirurgisk resektion af aganglionic/noncontractile væv, kronisk diætprodukter ændringer og/eller medicin. Overraskende, den fulde transkriptom af de voksne ENS er stadig at blive sekventeret, høj grad begrænser vores evne til at identificere molekyler i den ENS, der kan være målrettet farmaceutisk eller udnyttet i stamcelleterapier.
Der er relativt få metoder til isolering af RNA fra menneskelige enterisk ganglier. Den første fremgangsmåde, celle dissociation2, kræver høj inkubation temperaturer og lang inkubationstid gange; både som er kendt for at fremme RNA nedbrydning og ændre transkriptom2,3. En alternativ tilgang, LCM, mere pålideligt bevarer transkriptom og beskytter RNA integritet. Selv om flere undersøgelser har brugt LCM for at indsamle ganglier fra frisk frosset menneskelige tarmens væv4,5,6, disse tilgange var enten hæmmet af dårlige RNA kvalitet og kvantitet, var meget arbejdskrævende, eller behov for ændring af farvning eller RNA udvinding teknikker til at arbejde i vores hænder. Andre LCM protokoller designet til at bevare RNA, der blev fundet i LCM produkt manualer leveres yderligere forbedringer7,8, men tilpasning var nødvendig når anvendes til isolering af entero ganglier8, 9. af disse grunde har vi udviklet en optimeret protokol baseret på disse ressourcer, der giver betydelige mængder af høj-integritet RNA fra menneskelige enterisk ganglier, har en relativt hurtig arbejdsgang og producerer ensartede resultater på tværs af en stor antallet af prøver.
I denne undersøgelse præsenterer vi en synopsis af optimeret procedurer, som letter isolering af høj-integritet RNA fra enterisk ganglier stammer fra resektion menneskelige tarmens væv. Vores metode omfatter fem vigtige aspekter. Første, frisk resektion, ikke optagne menneskelige intestinal prøver skal trimmes til størrelse, har alle overskydende fugt fjernes med et laboratorium væv og fladtrykt i en stor base mug før flash-frysning på toppen af en opslemning af tøris og 2-methylbutane (2 MB). Andet, histologiske dele af tarmen skal være parat til at opnå det fulde plan af myenteric plexus på et dias, som giver en stor nyttelast på enteriske ganglier. Succes med dette trin er stort set afhængig af væv forberedelse proces. For det tredje kræver ganglier i ENS uensartet struktur brug af polyethylen napthalate (PEN) membran dias6, som tilbyder den største hastighed og præcision under LCM-processen. Fjerde, ethanol-kompatible farvestoffer, som Cresyl Violet, bør anvendes til at bevare RNA integritet mens farvning enterisk ganglier. Sidst, RNA udvinding proces er afgørende for et vellykket resultat med RNA-FF. Vi søgte en RNA udvinding tilgang, der producerer høj RNA integritet, maksimerer RNA udbytter, når du starter med små samlinger af entero ganglier, eliminerer DNA forurening og bevarer så mange RNA arter som muligt.
Tilsammen, optimering af disse faktorer i den nuværende undersøgelse væsentligt accelererer arbejdsprocessen og udbytter prøver af entero ganglier med ekstraordinære RNA kvantitet og kvalitet. Resultaterne har været stort set ensartet blandt en anselig gruppe af prøver, der angiver sammenhængen i denne tilgang. Yderligere, har vi brugt disse tilgange til med held sekvens snesevis af RNA prøver fra enterisk ganglier. De strategier, der er fremhævet her kan også tilpasses stort set til at udføre LCM af ønskede ganglier eller kerner af perifere og centrale nervesystem og andre sager, der kræver isolering af høj kvalitet RNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne procedure giver mulighed for effektiv indsamling af mange enteriske ganglier som en kilde til at udlede RNA til RNA-FF. Her har vi fremskyndet de processer, der er skitseret i eksisterende protokoller samtidig maksimalt bevare RNA integritet. Alle trin i denne procedure er indbyrdes afhængige, er det vigtigt, at alle emner fjernes fra starten af undersøgelsen, og at alle prøver er forberedt så ligeledes til hinanden som muligt, at opnå pålidelige RNA-FF.
Fra starten af proceduren, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for donorerne og deres familier, der har gjort dette arbejde muligt. Vi værdsætter også hjælp fra personalet på International Institute of Medicine og Tennessee Donor tjenester for at hjælpe koordinere indsamling af væv, der anvendes i denne undersøgelse. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 til EMS2 og stipendium opbakning fra NIH T32-DK007673 til AMZ. Vi er taknemmelige for personale på Vanderbilt translationel patologi delt ressource adgang til LCM Instrument og rådgivning om væv forberedelse. Den Vanderbilt væv patologi delt ressource er delvist understøttet af NIH tilskud P30-CA068485-14 og U24-DK059637-13. Vi takker genom teknologi adgang Center i Institut for Genetik på Washington University School of Medicine for hjælp med genomisk analyse. GTAC er delvist støttet af NCI Cancer Center støtte Grant #P30 CA91842 til Siteman Cancer Center og ikt/CTSA Grant #UL1TR002345 fra det nationale Center for forskning ressourcer (NCRR), en del af National Institutes of Health (NIH) og NIH Køreplan for medicinsk forskning. Denne publikation er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle visning af NCRR eller NIH.
Materials
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
- Gershon, M. D. . The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- . PALM Protocols – RNA handling Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011)
- . Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015)
- . Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3′ tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W. Laser capture. Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
