लेजर के अनुकूलन-कब्जा Microdissection के अलगाव के लिए प्रवेश गैंग्लिया से ताजा-जमे हुए मानव ऊतक
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य लेजर कैप्चर microdissection (LCM) का उपयोग कर स्थिर, हौसले से संप्रदाय मानव आंत्र ऊतक से पृथक दर्जी गैंग्लिया से उच्च अखंडता आरएनए नमूने प्राप्त करने के लिए है । इस प्रोटोकॉल मानव आंत्र ऊतक, cryosectioning, इथेनॉल धुंधला और निर्जलीकरण, LCM, और आरएनए निष्कर्षण के फ्लैश जमे हुए नमूनों की तैयारी शामिल है ।
Abstract
इस विधि का उद्देश्य लेजर कैप्चर microdissection (LCM) का उपयोग कर स्थिर, हौसले से संप्रदाय मानव आंत्र ऊतक से एकत्र दर्जी गैंग्लिया से उच्च अखंडता आरएनए नमूने प्राप्त करने के लिए है । हम आरएनए प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि कार्यप्रवाह में पांच चरणों की पहचान की है पर्याप्त रूप से उच्च गुणवत्ता और आरएनए-seq के लिए मात्रा के साथ दर्जी गैंग्लिया से अलग. आंतों के ऊतकों की तैयारी करते हैं, सबसे पहले, प्रत्येक नमूना बड़े बेस मोल्ड के तल भर में जितना संभव हो serosa समतल करने से पहले सोख्ता द्वारा हटाया सभी अतिरिक्त तरल होना चाहिए । नमूने तो जल्दी सूखी बर्फ और 2-methylbutane का एक घोल के ऊपर जमे हुए हैं । दूसरा, जब ऊतक अनुभाग, यह स्थिति cryomolds इतना महत्वपूर्ण है कि आंत्र वर्गों myenteric जाल के समानांतर पूर्ण विमान है, जिससे स्लाइड प्रति एंट्रेंस गैंग्लिया की सबसे बड़ी सतह क्षेत्र उपज । तीसरा, LCM के दौरान, पॉलीथीन napthalate (कलम)-झिल्ली स्लाइड प्रवेश गैंग्लिया के गैर-यूनिफ़ॉर्म आकार जब प्रवेश गैंग्लिया इकट्ठा करने में सबसे बड़ी गति और लचीलापन प्रदान करते हैं । चौथा, वर्गों के भीतर प्रवेश गैंग्लिया के अलग दृश्य के लिए, Cresyl वायलेट की तरह इथेनॉल-संगत रंजक, जलीय रंगों के सापेक्ष आरएनए अखंडता के उत्कृष्ट संरक्षण प्रदान करते हैं । अंत में, पर कब्जा कर लिया गैंग्लिया से आरएनए के निष्कर्षण के लिए, हम वाणिज्यिक आरएनए निष्कर्षण किट है कि बेहतर आरएनए मात्रा और गुणवत्ता की उपज के बीच मतभेद मनाया, जबकि डीएनए संदूषण को नष्ट करने. वर्तमान प्रोटोकॉल में इन कारकों का अनुकूलन बहुत कार्यप्रवाह और पैदावार असाधारण आरएनए गुणवत्ता और मात्रा के साथ दर्जी गैंग्लिया नमूनों में तेजी लाने ।
Introduction
इस विधि लेजर कैप्चर microdissection (LCM) का उपयोग कर मानव आंत्र ऊतक से उच्च गुणवत्ता आरएनए नमूने दर्जी गैंग्लिया प्राप्त करने के लिए बनाया गया है । यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-seq) के लिए पर्याप्त आरएनए गुणवत्ता और पैदावार प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया गया है और हौसले से संप्रदाय, स्थिर, फ्लैश-जमे हुए मानव आंत्र ऊतक के साथ इस्तेमाल किया जा करने के लिए इरादा है ।
कार्यात्मक जठरांत्र और आंत गतिशीलता विकारों संयुक्त राज्य अमेरिका में हर चार लोगों में से एक को प्रभावित । यह पेट homeostasis और गतिशीलता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, क्योंकि यह भी दूसरा1मस्तिष्क के रूप में संदर्भित, प्रवेश तंत्रिका तंत्र (िनों), अक्सर इन विकारों के केंद्र में है । आंत गतिशीलता के हेरफेर आम तौर पर aganglionic के सर्जिकल लकीर के लिए प्रतिबंधित किया गया है/noncontractile ऊतक, जीर्ण आहार संशोधन और/ आश्चर्य की बात है, वयस्क िनों के पूर्ण transcriptome के लिए अनुक्रम, बहुत िनों है कि दवा या स्टेम सेल उपचार में उपयोग किया जा सकता है के भीतर अणुओं की पहचान करने की क्षमता सीमित रहता है ।
मानव प्रवेशात्मक गैंग्लिया से आरएनए अलग करने के लिए अपेक्षाकृत कुछ तरीके हैं. पहला दृष्टिकोण, सेल पृथक्करण2, उच्च गर्मी तापमान और लंबे समय से मशीन समय की आवश्यकता है; दोनों जिनमें से आरएनए क्षरण को बढ़ावा देने और transcriptome2,3को बदलने के लिए जाना जाता है । एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, LCM, और अधिक मज़बूती से transcriptome को बरकरार रखता है और आरएनए अखंडता की रक्षा करता है । हालांकि कई अध्ययनों से ताजा जमे हुए मानव आंत्र ऊतक4,5,6से गैंग्लिया इकट्ठा करने के लिए LCM का इस्तेमाल किया है, इन तरीकों या तो गरीब आरएनए गुणवत्ता और मात्रा में बाधा थे, काफी श्रम प्रधान थे, या दाग या आरएनए निष्कर्षण तकनीकों के संशोधन की जरूरत हमारे हाथ में काम करने के लिए । आरएनए के संरक्षण के लिए डिजाइन किए गए अन्य LCM प्रोटोकॉल जो LCM उत्पाद नियमावली में पाए गए हैं,7,8अतिरिक्त सुधार प्रदान किए गए हैं, लेकिन अनुकूलन की जरूरत थी जब दर्ज की गई गैंग्लिया8के अलगाव के लिए लागू है, 9. इन कारणों के लिए, हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है कि मानव प्रवेश गैंग्लिया से उच्च अखंडता आरएनए की पर्याप्त मात्रा में पैदावार इन संसाधनों के आधार पर विकसित की है, एक अपेक्षाकृत तेजी से कार्यप्रवाह है, और एक बड़े पैमाने पर लगातार परिणाम पैदा करता है नमूनों की संख्या ।
इस अध्ययन में, हम अनुकूलित प्रक्रियाओं का एक सार प्रस्तुत करते हैं जो कि संप्रदायिक मानव आंत्र ऊतक से मंगवाया गया गैंग्लिया से उच्च अखंडता वाली आरएनए के अलगाव को सुकर बनाता है । हमारी विधि पांच महत्वपूर्ण पहलुओं को शामिल । पहले, हौसले से संप्रदाय, स्थिर मानव आंतों के नमूनों के आकार के लिए छंटनी की जानी चाहिए, सभी अतिरिक्त नमी एक प्रयोगशाला ऊतक के साथ हटा दिया है और एक बड़े बेस मोल्ड में समतल से पहले फ्लैश ठंड सूखी बर्फ और 2 के एक घोल के ऊपर-methylbutane (2-एमबी) । दूसरा, आंत के histologic वर्गों के लिए एक स्लाइड है, जो प्रवेश गैंग्लिया की एक बड़ी पेलोड प्रदान करता है पर myenteric जाल का पूरा विमान प्राप्त करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए । इस कदम के साथ सफलता काफी हद तक ऊतक तैयार करने की प्रक्रिया पर निर्भर है । तीसरा, िनों में गैंग्लिया की वर्दी संरचना पॉलीथीन napthalate (पेन) झिल्ली स्लाइड6, जो LCM प्रक्रिया के दौरान सबसे बड़ी गति और परिशुद्धता की पेशकश के उपयोग की आवश्यकता है । चौथा, इथेनॉल-संगत रंजक, जैसे Cresyl वायलेट, के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए आरएनए अखंडता की रक्षा करते हुए प्रवेश गैंग्लिया धुंधला । पिछले, आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया आरएनए-Seq के साथ एक सफल परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है । हम एक आरएनए निष्कर्षण दृष्टिकोण है कि उच्च आरएनए अखंडता का उत्पादन की मांग की, जब प्रवेश गैंग्लिया के छोटे से संग्रह के साथ शुरू आरएनए पैदावार को अधिकतम, डीएनए संदूषण समाप्त, और संभव के रूप में कई आरएनए प्रजातियों के रूप में बरकरार रखती है ।
एक साथ ले लिया, वर्तमान अध्ययन में इन कारकों का अनुकूलन बहुत कार्यप्रवाह और असाधारण आरएनए मात्रा और गुणवत्ता के साथ दर्जी गैंग्लिया के नमूने पैदावार में बढ़ौतरी । परिणाम काफी हद तक नमूनों की एक बड़ा समूह के बीच संगत किया गया है, इस दृष्टिकोण की निरंतरता का संकेत है । इसके अलावा, हम सफलतापूर्वक प्रवेश गैंग्लिया से आरएनए के नमूने के दर्जनों अनुक्रम के लिए इन तरीकों का इस्तेमाल किया है । यहां पर प्रकाश डाला रणनीति भी मोटे तौर पर वांछित गैंग्लिया या परिधीय और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और अंय उच्च गुणवत्ता आरएनए के अलगाव की आवश्यकता के मामलों के नाभिक के LCM प्रदर्शन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रक्रिया आरएनए-seq के लिए आरएनए प्राप्त करने के लिए एक स्रोत के रूप में कई एंट्रेंस गैंग्लिया के कुशल संग्रह को सक्षम बनाता है । यहां, हम मौजूदा प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रक्रियाओं तेज है, जबकि अधिक से…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम दानदाताओं और उनके परिवार वालों के आभारी हैं जिन्होंने यह काम संभव बनाया । हम भी इस अध्ययन में प्रयुक्त ऊतक के समंवय संग्रह में मदद करने के लिए चिकित्सा और टेनेसी दाता सेवाओं के अंतरराष्ट्रीय संस्थान में कर्मचारियों की सहायता की सराहना करते हैं । यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों, NIH OT2-OD023850 ईएमएस2 और NIH T32-DK007673 से AMZ करने के लिए वजीफा समर्थन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । हम LCM साधन और ऊतक तैयार करने पर सलाह के लिए उपयोग के लिए वेंडरबिल्ट शोधों पैथोलॉजी साझा संसाधन के कर्मचारियों के लिए आभारी हैं । वेंडरबिल्ट ऊतक विकृति साझा संसाधन NIH अनुदान P30-CA068485-14 और U24-DK059637-13 द्वारा भाग में समर्थित है । हम जीनोमिक विश्लेषण के साथ मदद के लिए वाशिंगटन विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन में आनुवंशिकी विभाग में जीनोम प्रौद्योगिकी का उपयोग केंद्र का शुक्र है । GTAC आंशिक रूप से NCI कैंसर केंद्र सहायता अनुदान द्वारा समर्थित है #P30 CA91842 Siteman कैंसर केंद्र के लिए और आईसीटी/CTSA अनुदान #UL1TR002345 से राष्ट्रीय अनुसंधान संसाधन के लिए केंद्र (NCRR), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) के एक घटक है, और NIH चिकित्सा अनुसंधान के लिए रोडमैप । यह प्रकाशन पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि NCRR या NIH के सरकारी दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
Materials
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
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