Summary

Ottimizzazione di Laser Capture Microdissection per l'isolamento dei gangli enterici dal tessuto umano fresco congelato

Published: June 14, 2018
doi:

Summary

L’obiettivo del presente protocollo è quello di ottenere campioni di RNA ad alta integrità dai gangli enterici isolati dal tessuto intestinale umano non fissato, appena resecato mediante microdissezione laser (LCM). Questo protocollo prevede preparazione flash-congelati campioni di tessuto intestinale umano, cryosectioning, colorazione etanolica e disidratazione, LCM e l’estrazione di RNA.

Abstract

Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere campioni di RNA ad alta integrità dai gangli enterici raccolti da tessuto intestinale umano non fissato, appena resecato mediante microdissezione laser (LCM). Abbiamo identificato cinque passaggi del flusso di lavoro che sono cruciali per l’ottenimento di RNA isolati dai gangli enterici con sufficientemente alta qualità e quantità per RNA-seq. In primo luogo, quando si prepara il tessuto intestinale, ogni campione deve avere tutto il liquido in eccesso rimosso dal macchiare prima della spianatura serosa quanto possibile nella parte inferiore della grande stampi base. I campioni allora rapidamente sono congelati in cima a una miscela di ghiaccio secco e 2-metilbutano. In secondo luogo, durante il taglio del tessuto, è importante posizionare cryomolds modo che sezioni intestinali in parallelo il piano completo del plesso mioenterico, producendo quindi il maggiore della superficie dei gangli enterici per ogni diapositiva. Terzo, durante LCM, polietilene napthalate (PEN)-diapositive di membrana offrono la massima velocità e flessibilità nel delineare le forme non uniforme dei gangli enterici durante la raccolta dei gangli enterici. In quarto luogo, per la visualizzazione distinte dei gangli enterici all’interno delle sezioni, etanolo compatibile con coloranti, come la viola di Cresyl, offrono ottima conservazione dell’integrità di RNA rispetto acquose coloranti. Infine, per l’estrazione di RNA da gangli catturati, abbiamo osservato le differenze tra kit commerciali di estrazione RNA che restituito superior RNA quantità e qualità, eliminando la contaminazione del DNA. Ottimizzazione di questi fattori nel protocollo corrente notevolmente accelera il flusso di lavoro e produce campioni di gangli enterici con eccezionale qualità di RNA e la quantità.

Introduction

Questo metodo è progettato per ottenere campioni di RNA di alta qualità dei gangli enterici da tessuto intestinale umano mediante microdissezione laser (LCM). Il protocollo descritto qui è stato ottimizzato per fornire sufficiente qualità di RNA e rendimenti per RNA (RNA-seq) di sequenziamento ed è destinato a essere utilizzato con tessuto intestinale umano appena resecato, slegato, flash-congelato.

Disturbi funzionali della motilità gastrointestinale dell’intestino ed interessano uno su quattro persone negli Stati Uniti. Il sistema nervoso enterico (ENS), noto anche come il secondo cervello1, è spesso al centro di questi disordini, che svolge un ruolo fondamentale nell’omeostasi dell’intestino e motilità. Manipolazione della motilità intestinale è stato generalmente limitato a resezione chirurgica del tessuto aganglionic/noncontractile, modifica dietetica cronica e/o farmaci. Sorprendentemente, il trascrittoma completo del ENS adulto rimane essere sequenziato, limitando notevolmente la nostra capacità di identificare le molecole all’interno l’ENS che possono essere mirati farmacologicamente o utilizzate nelle terapie con cellule staminali.

Ci sono relativamente pochi metodi per l’isolamento di RNA dai gangli enterici umani. Il primo approccio, cella dissociazione2, richiede temperature di incubazione elevate e tempi di incubazione lungo; sia di cui sono noti per promuovere la degradazione del RNA e alterare il trascrittoma2,3. Un approccio alternativo, LCM, più attendibilmente conserva il trascrittoma e protegge l’integrità del RNA. Anche se parecchi studi hanno utilizzato LCM per raccogliere dei gangli da tessuto intestinale umano fresco congelato4,5,6, questi approcci erano sia ostacolata dalla scarsa qualità di RNA e la quantità, erano abbastanza laboriosi, o necessaria modifica di colorazione o di tecniche di estrazione di RNA a lavorare nelle nostre mani. Altri protocolli di LCM progettati per la conservazione del RNA che sono stati trovati nel prodotto di LCM manuali forniti ulteriori miglioramenti7,8, ma l’adattamento è stato necessario quando applicato all’isolamento di gangli enterici8, 9. per queste ragioni, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato basato su queste risorse che produce notevoli quantità di RNA ad alta integrità dai gangli enterici umani, ha un flusso di lavoro relativamente veloce e produce risultati coerenti attraverso un grande numero di campioni.

In questo studio, presentiamo una sintesi delle procedure ottimizzate che facilitano l’isolamento di RNA ad alta integrità dai gangli enterici provenienti da tessuto intestinale umano resecato. Il nostro metodo incorpora cinque aspetti importanti. Primi, appena resecato, unfixed campioni intestinali umani devono essere tagliati a misura, hanno tutta l’umidità in eccesso rimossi con un tessuto di laboratorio e appiattito in un grande stampo base prima del flash-congelamento in cima ad una miscela di ghiaccio secco e 2-metilbutano (2 MB). Seconda sezioni istologiche dell’intestino dovrebbero essere preparate per ottenere il piano completo del plesso myenteric in una diapositiva, che offre un payload di grandi dimensioni dei gangli enterici. Successo con questo passaggio dipende in larga misura il processo di preparazione del tessuto. In terzo luogo, la struttura non uniforme dei gangli in ENS richiede l’utilizzo di polietilene napthalate (PEN) membrana diapositive6, che offrono la massima velocità e precisione durante il processo di LCM. Coloranti quarto, etanolo-compatibile, ad esempio Cresyl Violet, dovrebbero essere utilizzati per preservare l’integrità di RNA durante la macchiatura dei gangli enterici. Infine, il processo di estrazione di RNA è fondamentale per un risultato di successo con RNA-seq. Abbiamo cercato un approccio di estrazione di RNA che produce alta integrità di RNA, massimizza RNA rendimenti quando si inizia con piccole collezioni di gangli enterici, Elimina la contaminazione di DNA e conserva specie di RNA come molti come possibile.

Presi insieme, ottimizzazione di questi fattori nel presente studio notevolmente accelera il flusso di lavoro e produce campioni dei gangli enterici con eccezionale quantità di RNA e di qualità. Risultati sono stati in gran parte coerenti tra un considerevole gruppo di campioni, che indica la consistenza di questo approccio. Inoltre, abbiamo usato questi approcci per sequenziato decine di campioni di RNA dai gangli enterici. Le strategie evidenziate qui possono anche essere ampiamente adattate per l’esecuzione di LCM di gangli desiderati o i nuclei dell’unità periferica e del sistema nervoso centrale e altri casi che richiedono l’isolamento di RNA di alta qualità.

Protocol

Tutti i protocolli descritti qui sono stati approvati dalla Vanderbilt University istituzionale Review Board (IRB). 1. preparazione prima dell’arrivo del tessuto Ottenere l’approvazione IRB corretto e coordinare con agenzie di donazione di organi umani per ottenere tessuto intestinale appena resecato, slegato da donatori che soddisfano tutti i criteri di ricerca necessari per lo studio.Nota: Questo protocollo può essere adattato per l’uso con topi e altri modelli del roditore.<o…

Representative Results

Abbiamo apportato diversi miglioramenti ai protocolli esistenti che consentono la raccolta relativamente rapida dei gangli enterici dai campioni intestinali umani utilizzando LCM, conforme agli standard per RNA-seq. In primo luogo, abbiamo ottimizzato il congelamento rapido di segmenti di tessuto intestinale in grandi stampi base collocati sulla superficie di un impasto di ghiaccio secco in 2 MB (Figura 1B). Il miglior successo durante cryose…

Discussion

Questa procedura consente la raccolta efficiente dei numerosi gangli enterici come fonte per la derivazione di RNA per RNA-seq. Qui, abbiamo abbiamo accelerato i processi illustrati in protocolli esistenti mantenendo al massimo l’integrità del RNA. Come tutti i passaggi di questa procedura sono interdipendenti, è importante che tutti i problemi verranno eliminati dall’inizio dello studio e che tutti i campioni sono preparati come similmente ad uno altro come possibile, per ottenere affidabile RNA-seq.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati per i donatori e le loro famiglie che hanno reso possibile questo lavoro. Apprezziamo anche l’assistenza di personale presso l’International Institute of Medicine e Tennessee Servizi per i donatori per aiutare la raccolta delle coordinate del tessuto utilizzato in questo studio. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 per supporto di EMS2 e stipendio da NIH T32-DK007673 a AMZ. Siamo grati al personale della Vanderbilt traslazionale patologia ha condiviso risorsa per l’accesso allo strumento di LCM e consigli sulla preparazione dei tessuti. La risorsa ha condiviso la foto di Vanderbilt tessuto patologia è sostenuta in parte da sovvenzioni NIH P30-CA068485-14 e U24-DK059637-13. Ringraziamo il genoma Technology Center di accesso del dipartimento di genetica presso la Washington University School of Medicine per aiuto con analisi genomica. Il GTAC è parzialmente supportato da NCI Cancer Center Support Grant #P30 CA91842 alla Siteman Cancer Center e da TIC/CTSA Grant #UL1TR002345 dal centro nazionale per ricerca risorse (NCRR), un componente del National Institutes of Health (NIH) e NIH Tabella di marcia per la ricerca medica. Questa pubblicazione è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente la posizione ufficiale di NCRR o NIH.

Materials

10% Neutral-buffered formalin Sigma HT501128-4L
2-Methylbutane Fisher O3551-4
3-mL syringe BD 309628
50-mL conical tubes, polypropylene  Corning 05-526B
Base molds 37x24x5mm, disposable Electron Microscopy Sciences 5025511
Belzer UW  Cold Storage Solution Bridge to Life N.A.
CapSure Macro LCM caps Arcturus, ThermoFisher LCM0211
Cling Wrap, Press’n Seal    Glad   N.A. 
Cresyl Violet Acetate Acros Organics AC405760025
Cutting Board Electron Microscopy Sciences 63308
Ethanol, 190-proof Pharmco-AAPER 111000190
Ethanol, 200-proof Pharmco-AAPER 111000200
Glass Microscope slides Fisher 12-550-343
Gloves, extended cuff Microflex  19010144
Gowns, surgical-disposable Kimberly-Clark  19-088-2116
Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) Nalgene   1335920B
Kimwipes (large) Kimberly-Clark  34120
Kimwipes (small) Kimberly-Clark  34133
Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) ThermoFisher N.A.
Leica Cryostat Chuck, large,  40 mm  Southeast Pathology Instrument Service N.A. 
Light Microscope Olympus CX43
Microscope objective (20X) Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 N.A.
Microscope objective (10X) Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- N.A. 
Molecular Sieves Acros Organics AC197255000
Nuclease-free water Ambion AM9937
PicoPure RNA extraction kit Applied Biosystems 12204-01
Pellet Pestle Kimble Kontes 4621973
PEN membrane LCM slides Arcturus, ThermoFisher LCM022
RNase-free tubes, 1.5 mL Ambion AM12400
RNaseZAP  Sigma Sigma-R2020
RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) Applied Biosystems 12204-01
RNA Extraction Kit "B" (RNeasy  Micro kit) Qiagen 74004
RNA Extraction Method "C" (TRIzol) Invitrogen 15596-026
RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) Qiagen 74134
Splash Shield, disposable faceshield Fisher 17-310
Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" Fine Science Tools 14002-14
Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) Nalgene   190-2520
Tissue Freezing Medium General Data Healthcare TFM-5
Xylenes Fisher X3P1GAL

References

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check_url/kr/57762?article_type=t

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Cite This Article
May-Zhang, A. A., Deal, K. K., Southard-Smith, E. M. Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue. J. Vis. Exp. (136), e57762, doi:10.3791/57762 (2018).

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