신선한 냉동 인간 조직에서 장의 중추의 격리에 대 한 레이저 캡처 서의 최적화
Summary
이 프로토콜의 목표에서 고정, 갓 절제 인간의 창 자 조직 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여 격리 장 중추에서 높은 무결성 RNA 샘플을 얻을 것입니다. 이 프로토콜 포함 플래시-냉동 인간 창 자 조직, cryosectioning, ethanolic 얼룩 및 탈수, LCM, 샘플 준비 및 RNA 추출.
Abstract
이 방법의 목적은 고정, 갓 절제 인간의 창 자 조직 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여에서 수집 하는 장 신경에서 높은 무결성 RNA 샘플을 얻을 것입니다. 5 단계 워크플로에서 RNA-이 대 한 충분히 높은 품질과 수량 장의 중추에서 RNA 분리를 얻기위한 중요 한를 확인 했습니다. 첫째, 준비할 때 장 조직, 각 샘플 아래쪽 큰 기본 금형의 가능한 serosa 병합 전에 blotting에 의해 제거 하는 모든 초과 액체를가지고 있어야 합니다. 다음 샘플 2 methylbutane 드라이 아이스의 슬러리 꼭대기 신속 하 게 고정 됩니다. 둘째, 조직 단면, 그것 장 섹션 슬라이드 당 장 신경의 가장 큰 표면 영역을 양보 함으로써 myenteric 총의 전체 평면 병렬 cryomolds 위치에 중요 하다. LCM, 폴 리 에틸렌 napthalate (펜) 중 세 번째-최고의 속도 장의 중추를 수집 하는 때 장 중추의 비균일 도형의 윤곽에 유연성을 제공 하는 막 슬라이드. 넷째, 섹션 내 장 신경의 고유한 시각화를 위한 Cresyl 바이올렛 같은 에탄올 호환 염료 수성 염료를 기준으로 RNA 무결성의 우수한 보존을 제공합니다. 마지막으로, 캡처된 중추에서 RNA 추출, 우리는 DNA 오염을 제거 하는 동안 우수한 RNA 수량 나왔고 상업적인 RNA 추출 키트와 품질, 차이점 관찰. 현재 프로토콜에서 이러한 요소의 최적화 크게 워크플로우를 가속화 하 고 뛰어난 RNA 품질 및 수량 장의 중추 샘플을 생성 합니다.
Introduction
이 메서드는 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여 인간의 창 자 조직에서 장의 중추의 높은-품질 RNA 샘플을 얻기 위해 설계 되었습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)에 대 한 충분 한 RNA 품질 및 수율을 제공 하도록 최적화 된 하며 갓 절제, 고정, 플래시-냉동 인간 창 자 조직으로 사용 될 것입니다.
기능성 위장 하 고 본질적인 운동 성 장애는 미국에서 4 명 중 하나에 영향을 줍니다. 장 신 경계 (ENS), 두 번째 뇌1라고도 종종 이러한 장애의 중심에 직감 항상성 및 운동에 중요 한 역할. 창 자 운동 성의 조작 일반적으로 aganglionic/noncontractile 조직, 만성 식이 수정 및/또는 약물의 외과 절제술으로 제한 되었습니다. 놀랍게도, 성인 팔의 전체 transcriptome 시퀀싱 할 약물 타겟 줄기 세포 치료에 활용 될 수 있는 ENS 내의 분자를 식별 하는 우리의 기능을 크게 제한 남아 있습니다.
인간의 장 중추에서 RNA를 분리 하는 데 상대적으로 몇 가지 방법이 있다. 첫 번째 접근 방법, 셀 분리2, 필요 높은 부 화 온도 및 긴 보육 시간; 모두는 RNA 저하를 촉진 하 고 변경 transcriptome2,3으로 알려져 있습니다. 다른 접근 방법, LCM, 더 안정적으로 transcriptome를 유지 하 고 RNA 무결성 보호. 이러한 방법 중 가난한 RNA 품질 및 수량에 의해 방해 했다, 아주 노동 집약, 여러 연구는 사용 하지만 LCM 신선한-냉동 인간 창 자 조직4,,56에서 중추를 수집, 또는 얼룩 또는 RNA 추출 기술을 우리의 손에서 일의 필요한 수정. LCM 제품 설명서 제공 장의 중추8, 의 분리에 적용 될 때 추가 개선7,8, 하지만 적응 필요에서 발견 된 다른 LCM 프로토콜 RNA를 보존 하기 위한 9. 이러한 이유로 우리는 최적화 된 프로토콜을 기반으로 이러한 리소스에는 인간의 장 중추에서 상당한 양의 높은 무결성 RNA 생성, 상대적으로 빠른 워크플로우, 그리고 대형에 걸쳐 일관 된 결과 생성을 개발 샘플의 수입니다.
이 연구에서 우리는 절제 인간의 창 자 조직에서 공급 하는 장 신경에서 높은 무결성 RNA의 분리를 용이 하 게 하는 최적화 된 절차의 개요를 제시. 우리의 방법 5 가지 중요 한 측면을 통합합니다. 첫째, 갓 절제, 고정 되지 않은 인간의 장 샘플 크기, 모든 과잉 습기 실험실 티슈로 제거 하 고 2-methylbutane (2 MB)과 드라이 아이스의 슬러리 꼭대기 플래시-냉동 하기 전에 큰 기본 몰드에 평평 하 게 손질 한다. 내장의 두 번째, 더 섹션 장의 중추의 큰 페이로드를 제공 하는 슬라이드에 myenteric 총의 전체 평면을 얻기 위해 준비 되어야 한다. 성공이 단계는 조직 준비 과정에 크게 의존 합니다. 셋째, 중추는 존재에의 비균일 구조 폴 리 에틸렌 napthalate (펜) 막 슬라이드6, LCM 과정에서 최고의 속도 정밀도 제공 하는 사용을 해야 합니다. Cresyl 바이올렛 등 4, 에탄올 호환 염료 장의 중추 얼룩 동안 RNA 무결성을 유지 하기 위해 사용 되어야 한다. 마지막으로, RNA 추출 과정은 RNA-시퀀스와 성공적인 결과 위해 중요 한 우리는 높은 RNA 무결성, 장 신경의 작은 컬렉션을 시작할 때 RNA 수율을 극대화, DNA 오염 제거 하 고 가능한 많은 RNA 종 유지 RNA 추출 방법을 모색.
함께 찍은, 현재 연구에서 이러한 요소의 최적화 크게 가속 워크플로 및 장의 중추 뛰어난 RNA 수량 및 품질의 샘플을 생성. 결과이 접근의 일관성을 나타내는 샘플의 상당한 그룹 간에 크게 일관 되었습니다. 또한, 이러한 접근 수십 장의 중추에서 RNA 샘플을 성공적으로 시퀀싱을 사용 했습니다. 여기에서 강조 하는 전략 수행 원하는 중추의 LCM 또는 주변 장치 및 중앙 신 경계와 높은-품질 RNA의 절연이 필요한 다른 경우의 핵에 대 한 광범위 하 게 적응 수 있습니다 또한.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 절차 RNA-이 대 한 RNA를 파생 하는 원본으로 수많은 장 중추의 효율적인 수집 가능 여기, 우리가 극대로 RNA 무결성을 유지 하면서 기존 프로토콜에서 설명 하는 프로세스를 가속 있다. 이 절차의 모든 단계는 상호 의존, 그것은 중요 한 연구의 개시에서 모든 문제를 제거 하 고는 모든 샘플 준비가 되어로 유사 하 게 다른 가능한 신뢰할 수 있는 RNA-이를
절차의 개시에서 RNA 무…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 기증자와이 일을 가능 하 게 그들의 가족에 감사입니다. 우리는 또한 국제 의학 연구소 및 테네시 기증자 서비스 조직의이 연구에 사용 된 좌표 컬렉션을 돕는 직원의 도움을 주셔서 감사 합니다. 이 작품은 건강의 국가 학회, NIH OT2-OD023850 EMS2 와 봉급 지원 NIH에서 T32 일부-DK007673 AMZ 하에서 교부 금에 의해 지원 되었다. 우리는 밴 더 빌 트 변환 병리학 공유 리소스의 직원 조직 준비에 조언과 LCM 악기에 대 한 액세스 감사입니다. 밴 더 빌 트 조직 병리학 공유 리소스 NIH P30-CA068485-14 보조금과 U24-DK059637-13에 의해 부분에서 지원 됩니다. 우리는 게놈 분석에 대 한 게놈 기술 접근 센터 워싱톤 대학의과 대학에 유전학의 부에 감사합니다. GTAC는 부분적으로 지원 됩니다 Siteman 암 센터 NCI 암 센터 지원 그랜트 #P30 CA91842와 국립 센터에서 ICTS/CTSA 그랜트 #UL1TR002345 연구 자원 (NCRR), 국립 보건원 (NIH), 그리고 NIH의 구성 요소에 대 한 의료 연구에 대 한 로드맵입니다. 이 간행물은 전적으로 저자의 책임 고 반드시 NCRR 또는 NIH의 공식 보기를 대표 하지 않는다.
Materials
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
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