Optimalisering av Laser-fangst Microdissection for isolering av innstigning Ganglion fra frisk-frosne menneskelig vev
Summary
Målet med denne protokollen er å oppnå høy integritet RNA prøver fra innstigning Ganglion isolert fra unfixed, fersk resected menneskelige tarmen tissue bruker laser fange microdissection (LCM). Denne protokollen involverer forberede flash-frosne prøver av menneskelige tarmen tissue, og kryosnitt, ethanolic flekker og dehydrering, LCM, og RNA utvinning.
Abstract
Formålet med denne metoden er å få høy integritet RNA prøver fra innstigning Ganglion fra unfixed, fersk resected menneskelige tarmen tissue bruker laser fange microdissection (LCM). Vi har identifisert fem trinn i arbeidsflyten som er avgjørende for å få RNA isolerer fra innstigning Ganglion med tilstrekkelig høy kvalitet og kvantitet for RNA-seq. Først når du forbereder tarmen tissue, må hvert utvalg ha alle overflødig væske fjernet av blotting før sammenslåing serosa som mulig langs bunnen av stor base muggsopp. Eksempler er så raskt frosset på toppen av en blanding av tørris og 2-methylbutane. Andre ved snitting vevet, er det viktig å plassere cryomolds slik at intestinal deler parallell full flyet myenteric plexus, og dermed gir det største arealet på enteric Ganglion per lysbilde. Tredje, under LCM, polyetylen napthalate (PENN)-membran lysbilder tilbyr den største hastighet og fleksibilitet i beskriver ikke-uniform former av innstigning Ganglion når innstigning Ganglion. Fjerde, tydelig visualisering av innstigning Ganglion i inndelinger, etanol-kompatible fargestoffer, som Cresyl Violet, tilbyr utmerket bevaring av RNA integritet i forhold til vandig fargestoffer. Til slutt, for utvinning av RNA fra fanget Ganglion, vi observerte forskjeller mellom kommersielle RNA utvinning kits som gitt overlegen RNA antall og kvalitet, mens de eliminerer DNA forurensning. Optimalisering av disse faktorene i gjeldende protokollen sterkt akselererer arbeidsflyten og gir enteric Ganglion utvalg eksepsjonelle RNA kvalitet og kvantitet.
Introduction
Denne metoden er utformet for å få høy kvalitet RNA eksempler på enteric Ganglion fra menneskelige tarmen tissue bruker laser fange microdissection (LCM). Protokollen beskrevet her er optimalisert for å gi tilstrekkelig RNA kvalitet og gir for RNA sekvensering (RNA-seq) og er ment å brukes med fersk resected, unfixed, flash-frosne menneskelige tarmen tissue.
Funksjonell gastrointestinal og gut motilitet lidelser påvirke en av hver fire personer i USA. Det enteric nervesystemet (ENS), også referert til som den andre hjerne1, er ofte på midten av disse lidelsene, som spiller en avgjørende rolle i tarmen homeostase og motilitet. Manipulering av gut motilitet er vanligvis begrenset til kirurgisk fjerning av aganglionic/noncontractile vev, kronisk kosttilskudd modifikasjoner eller medisiner. Overraskende, gjenstår den fulle transcriptome av voksen ENS å være sekvensert, sterkt begrenser vår evne til å identifisere molekyler innenfor ENS som kan være målrettet pharmaceutically eller brukes i stamcelleforskningen terapi.
Det er relativt få metoder for å isolere RNA fra menneskelige enteric Ganglion. Den første tilnærmingen, celle dissosiasjon2, krever høy inkubasjon temperaturer og lange inkubasjonstiden ganger; både som er kjent for å fremme RNA fornedrelse og endre transcriptome2,3. En alternativ tilnærming, LCM, mer pålitelig bevarer transcriptome og beskytter RNA integritet. Selv om flere studier har brukt LCM samle Ganglion frisk-frosne menneskelige tarmen tissue4,5,6, disse var enten hemmet av dårlig RNA kvalitet og kvantitet, var ganske arbeidskrevende, eller nødvendig endring av flekker eller RNA utvinning teknikker for å arbeide i våre hender. Andre LCM protokollene designet for å bevare RNA som ble funnet i LCM produkt håndbøker gitt ytterligere forbedringer7,8, men tilpasning var nødvendig når isolering av innstigning Ganglion8, 9. disse grunner vi utviklet en optimalisert protokoll basert på disse ressursene som gir vesentlig kvantiteter av høy integritet fra menneskelige enteric Ganglion, har en relativt rask arbeidsflyt og gir konsekvent resultater en stor Antallet eksempler.
I denne studien presenterer vi et sammendrag av optimalisert prosedyrer som letter isolering av høy integritet RNA fra innstigning Ganglion fra resected menneskelige tarmen tissue. Vår metode inneholder fem viktige aspekter. Første, fersk resected, unfixed menneskelige tarmen prøver skal trimmes størrelse, har alle fuktighet fjernes med et laboratorium vev og flate i en stor base mold før flash-Underkjølt på toppen av en blanding av tørris og 2-methylbutane (2 MB). Andre, histologic deler av tarmen bør være forberedt på å få full flyet myenteric plexus på et lysbilde, som tilbyr en stor nyttelast på enteric Ganglion. Suksess med dette trinnet er i stor grad avhengig av vev forberedelsesprosessen. Tredje krever uensartet strukturen til Ganglion i ENS bruk av polyetylen napthalate (PENN) membran lysbilder6, som tilbyr størst fart og presisjon under LCM prosessen. Fjerde, etanol-kompatibel fargestoffer, som Cresyl Violet, bør brukes å bevare RNA integritet når flekker enteric Ganglion. Sist, RNA utvinning prosessen er avgjørende for å lykkes med RNA-Seq. Vi søkte en RNA utvinning tilnærming som produserer høy RNA integritet, maksimerer RNA gir når du starter med små samlinger av innstigning Ganglion, eliminerer DNA forurensning og beholder så mange RNA arter som mulig.
Samlet optimalisering av disse faktorene studien sterkt akselererer arbeidsflyten og gir eksempler på enteric Ganglion med eksepsjonell RNA kvantitet og kvalitet. Resultatene har vært stort sett konsekvent blant en stor gruppe av prøver, indikerer konsistensen av denne tilnærmingen. Videre har vi brukt disse metodene til vellykket sekvens dusinvis av RNA prøver fra innstigning Ganglion. Strategiene uthevet her kan også være bredt tilpasset for å utføre LCM av ønsket Ganglion eller kjerner tilleggsutstyret og sentralnervesystemet og andre tilfeller krever isolering av høy kvalitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne fremgangsmåten kan effektiv innsamling av mange enteric Ganglion som kilde å utlede RNA for RNA-seq. Her har vi akselerert prosessene som er beskrevet i eksisterende protokoller samtidig bevare maksimalt RNA integritet. Som alle trinnene i denne fremgangsmåten er avhengige av hverandre, er det viktig at alle problemer bli eliminert fra starten av studien, og at alle prøvene er forberedt som tilsvarende til hverandre som mulig, å få pålitelig RNA-seq.
Fra starten av prosedyren, kan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til givere og deres familier som gjorde dette arbeidet mulig. Vi takker også hjelp av personalet ved International Institute of Medicine og Tennessee Donor tjenester for å hjelpe koordinere samling av vev som er brukt i denne studien. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 til EMS2 og stipend støtte fra NIH T32-DK007673 til AMZ. Vi er takknemlige til ansatte i Vanderbilt translasjonsforskning patologi delte ressursen tilgang til MFM Instrument og råd om vev forberedelse. Vanderbilt vev patologi delte ressursen støttes delvis av NIH tilskudd P30-CA068485-14 og U24-DK059637-13. Vi takker genomet Technology Access Center i genetikk ved Washington University School of Medicine for hjelp med genomisk analyse. GTAC støttes delvis NCI Cancer Center støtte Grant #P30 CA91842 til Siteman Cancer Center og IKT/CTSA Grant #UL1TR002345 fra National Center for forskning ressurser (NCRR), en komponent av National Institutes of Health (NIH) og NIH Veikart for medisinsk forskning. Denne publikasjonen er ansvar forfatterne, og nødvendigvis representerer ikke offisielle visningen av NCRR eller NIH.
Materials
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
- Gershon, M. D. . The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- . PALM Protocols – RNA handling Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011)
- . Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015)
- . Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3′ tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W. Laser capture. Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
