Optimización del Microdissection de la captura de láser para el aislamiento de los ganglios entéricos de tejido humano fresco congelado
Summary
El objetivo de este protocolo es obtener muestras de RNA de alta integridad de ganglios entéricos aislados del tejido intestinal humano no fijado, recién resecado usando el microdissection de la captura de láser (LCM). Este protocolo implica preparación de flash-congeladas muestras de tejido intestinal humano, cryosectioning, coloración etanólico y deshidratación, LCM y la extracción de RNA.
Abstract
El propósito de este método es obtener muestras de RNA de alta integridad de ganglios entéricos de interpretaciones, recién resecado tejido intestinal humano usando el microdissection de la captura de láser (LCM). Hemos identificado cinco pasos en el flujo de trabajo que son cruciales para la obtención de RNA aislados de ganglios entéricos con suficiente calidad y cantidad de RNA-seq. En primer lugar, preparar el tejido intestinal, cada muestra debe tener todo exceso de líquido eliminado por borrar antes de aplanar la serosa tanto como sea posible a través del fondo de grandes moldes base. Las muestras entonces se congelan rápidamente encima de una mezcla de hielo seco y 2-Metilbutano. En segundo lugar, al seccionar los tejidos, es importante posicionar cryomolds para que las secciones intestinales paralelas el plano completo del plexo mientérico, produciendo así la mayor superficie de ganglios entéricos por diapositiva. Tercero, en la LCM, polietileno napthalate (PEN)-diapositivas de membrana ofrecen la mayor velocidad y flexibilidad en las formas no uniformes de ganglios entéricos el recoger los ganglios entéricos. En cuarto lugar, para la clara visualización de ganglios entéricos dentro de las secciones, colorantes compatibles con etanol, como el violeta de cresilo, ofrecen excelente preservación de la integridad del RNA en relación con tintes acuosos. Finalmente, para la extracción del ARN de los ganglios capturados, observamos diferencias entre los kits comerciales de extracción RNA que rindieron superior cantidad de RNA y de calidad, eliminando la contaminación del ADN. Optimización de estos factores en el protocolo actual en gran medida acelera el flujo de trabajo y da muestras de los ganglios entéricos con excepcional calidad de RNA y la cantidad.
Introduction
Este método está diseñado para obtener muestras de RNA de alta calidad de ganglios entéricos de tejido intestinal humano usando el microdissection de la captura de láser (LCM). El protocolo descrito aquí ha sido optimizado para proporcionar suficiente RNA calidad y rendimientos para ARN de secuencia (RNA-seq) y está destinado a ser utilizado con tejido intestinal humano recién resecado, interpretaciones, flash-congeladas.
Trastornos de la motilidad gastrointestinal y tripas funcionales afectan uno de cada cuatro personas en los Estados Unidos. El sistema nervioso entérico (ENS), también conocido como el segundo cerebro1, es a menudo en el centro de estos trastornos, como juega un papel fundamental en la homeostasis intestinal y la motilidad. Manipulación de la motilidad intestinal generalmente está limitado a la resección quirúrgica del tejido agangliónico/noncontractile, modificación dietética crónica y/o medicamentos. Sorprendentemente, el transcriptoma completo de la ENS adultos queda ser secuenciado, limitando enormemente nuestra capacidad para identificar las moléculas dentro de la ENS que pueden ser dirigidos farmacéuticamente o utilizados en terapias con células madre.
Hay relativamente pocos métodos para aislar RNA ganglios entéricos humanos. El primer enfoque, disociación celular2requiere incubación altas temperaturas y tiempos de incubación; tanto que se conocen para promover la degradación del RNA y alterar el transcriptoma2,3. Un enfoque alternativo, LCM, más confiablemente conserva el transcriptoma y protege la integridad del RNA. Aunque varios estudios han utilizado LCM para recoger los ganglios del tejido intestinal humano fresco congelado4,5,6, estos enfoques tampoco fueron obstaculizados por la pobre cantidad y calidad de RNA, eran muy intensivas, o necesaria modificación de la tinción o técnicas de extracción de RNA para trabajar en nuestras manos. Otros protocolos de LCM diseñados para la preservación de RNA que se encuentran en productos de LCM manuales proporcionan mejoras adicionales7,8, pero la adaptación era necesario cuando se aplica al aislamiento de los ganglios entéricos8, 9. por estas razones, hemos desarrollado un protocolo optimizado basado en estos recursos que rinde cantidades sustanciales de RNA de alta integridad de ganglios entéricos humanos, tiene un flujo de trabajo relativamente rápido y produce resultados consistentes a través de una gran número de muestras.
En este estudio, presentamos una sinopsis de los procedimientos optimizados que facilitan el aislamiento de ARN de alta integridad de ganglios entéricos de tejido intestinal humano resecado. Nuestro método incorpora cinco aspectos importantes. Primeras, recién resecado, interpretaciones muestras intestinales humanas deben recortarse en tamaño, tienen todo el exceso de humedad quitada con un pañuelo de laboratorio y aplastada en un molde grande de base antes de la congelación de flash encima de una mezcla de hielo seco y 2-Metilbutano (2 MB). En segundo lugar, histologic secciones del intestino deben estar preparadas para obtener el plano completo del plexo mientérico en un portaobjetos, que ofrece una gran capacidad de carga de ganglios entéricos. Éxito con este paso depende en gran medida del proceso de preparación del tejido. En tercer lugar, la estructura no uniforme de los ganglios en la ENS requiere el uso de polietileno napthalate (PEN) membrana diapositivas6, que ofrecen la mayor velocidad y precisión durante el proceso de la LCM. Tintes en cuarto lugar, compatible con etanol, como el violeta de cresilo, puede usarse para preservar la integridad del RNA mientras manchaba los ganglios entéricos. Por último, el proceso de extracción de RNA es fundamental para un resultado exitoso con RNA-seq. Buscamos un enfoque de extracción de RNA que produce alta integridad del RNA, maximiza rendimientos RNA cuando a partir de pequeñas colecciones de ganglios entéricos, elimina la contaminación de ADN y conserva especies de RNA como muchos como sea posible.
Tomados en conjunto, optimización de estos factores en el presente estudio grandemente acelera el flujo de trabajo y da muestras de ganglios entéricos con la excepcional cantidad de RNA y la calidad. Resultados han sido en gran parte constantes entre un grupo considerable de muestras, indicando que la consistencia de este enfoque. Además, hemos utilizado estos enfoques secuenciar con éxito decenas de muestras de RNA de los ganglios entéricos. Las estrategias aquí destacadas también ampliamente adaptables para la realización de LCM de deseada de los ganglios o núcleos de periférico y sistema nervioso central y otros casos que requieren el aislamiento del ARN de alta calidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este procedimiento permite la eficiente recopilación de numerosos ganglios entéricos como fuente para obtener RNA para RNA-seq. Aquí, hemos acelerado los procesos descritos en los protocolos existentes al máximo preservar integridad del RNA. Como todos los pasos de este procedimiento son interdependientes, es importante eliminar todos los problemas desde el inicio del estudio y que todas las muestras se preparan como semejantemente uno al otro como sea posible, para obtener confiable RNA-seq.
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los donantes y sus familias que hicieron posible este trabajo. También agradecemos la asistencia de personal en el Instituto Internacional de medicina y servicios de donantes de Tennessee para ayudar a coordinar colección de tejido utilizado en este estudio. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los institutos nacionales de salud, NIH OT2-OD023850 a EMS2 y estipendio apoyo de NIH T32-DK007673 al AMZ. Agradecemos al personal de Vanderbilt traslacional patología compartida del recurso de acceso al instrumento de LCM y asesoramiento sobre la preparación de tejido. El recurso de compartido de patología de tejido Vanderbilt es apoyado en parte por subvenciones de NIH P30-CA068485-14 y U24-DK059637-13. Agradecemos el genoma tecnología centro de acceso en el Departamento de genética de la escuela de medicina de la Universidad de Washington ayuda con análisis genomic. El GTAC es parcialmente apoyado por NCI cáncer centro apoyo beca #P30 CA91842 al centro de cáncer Siteman y por TIC/CTSA Grant #UL1TR002345 del centro nacional para recursos de investigación (NCRR), un componente de los institutos nacionales de salud (NIH) y los NIH Hoja de ruta para la investigación médica. Esta publicación es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de NCRR o NIH.
Materials
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
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