Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için
Summary
Bu iletişim kuralı, enterik gangliyon lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak sabitlenmemiş, taze rezeke insan bağırsak dokusundan izole yüksek bütünlük RNA örnekleri almak için hedeftir. Bu protokol flaş donmuş örnekleri insan bağırsak dokusu, cryosectioning, ethanolic boyama ve dehidratasyon, LCM, hazırlanıyor içerir ve RNA çıkarma.
Abstract
Bu yöntemin amacı enterik gangliyon lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak sabitlenmemiş, taze rezeke insan bağırsak dokusu toplanan yüksek bütünlük RNA örnekleri elde etmektir. Biz RNA yalıtır enterik gangliyon yeterince yüksek kalite ve miktar üzerinden RNA-devamı için almak için çok önemli beş adım iş akışında belirledik Öncelikle, bağırsak dokusu hazırlanırken, her örnek serosa mümkün olduğu kadar büyük temel kalıpları alt kısmında düzleştirme önce Blot tarafından kaldırıldı tüm aşırı sıvı olması gerekir. Örnekleri daha sonra hızlı bir şekilde Kuru buz ve 2-methylbutane bir bulamaç donmuş. İkinci olarak, ne zaman doku kesit, cryomolds bağırsak bölümler böylece slayt başına enterik gangliyon en büyük yüzey alanı verimli myenteric pleksus tam boyutunda paralel şekilde konumlandırmak önemlidir. LCM, polietilen napthalate (kalem) sırasında üçüncü-membran slaytlar teklif en büyük hız ve enterik gangliyon toplarken enterik gangliyon üniform olmayan şekiller anahat oluşturma esnekliği. Dördüncü olarak, enterik gangliyon bölümleri içinde farklı görselleştirme için etanol uyumlu boya, kresil mor gibi sulu boya göre RNA bütünlüğünü mükemmel koruma sunuyoruz. Son olarak, yakalanan gangliyon gelen RNA çıkarılması için biz DNA kirlenme ayrıcılıklarına olan üstün RNA miktarı vermiştir ticari RNA ayıklama kitleri ve kalite arasındaki farklar görülmektedir. Geçerli protokol bu faktörlerin en iyi duruma getirme büyük ölçüde iş akışını hızlandırır ve enterik gangliyon örnekler olağanüstü RNA kalite ve miktar ile verimleri.
Introduction
Bu yöntem yüksek kaliteli RNA örnekleri enterik gangliyon lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak insan bağırsak dokusundan elde etmek için tasarlanmıştır. Burada açıklanan Protokolü (RNA-seq) sıralama RNA için yeterli RNA kalite ve verim sağlamak için en iyi duruma getirilmiş ve taze rezeke, sabitlenmemiş, flaş donmuş insan bağırsak dokusu ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır.
Fonksiyonel gastrointestinal ve gut motilite bozuklukları her dört kişi Amerika Birleşik Devletleri’nde etkiler. Gut homeostazı ve hareketliliği çok önemli bir rol oynar gibi enterik sinir sistemi (ENS), ikinci beyin1olarak da sık sık bu bozuklukların merkezinde bulunur. Bağırsakları manipülasyon genellikle cerrahi rezeksiyon aganglionic/noncontractile doku, kronik diyet değişiklik ve/veya ilaçlar için sınırlama getirildi. Doğal olarak, Yetişkin ENS tam transcriptome sıralı için büyük ölçüde molekülleri pharmaceutically hedef veya kök hücre tedavileri içinde kullanılan ENS içinde tanımlama yeteneği bizim sınırlama kalır.
RNA insan enterik gangliyon izole için nispeten daha az sayıda yöntem vardır. İlk yaklaşım, hücre ayrılma2, yüksek inkübasyon sıcaklığı ve uzun bir kuluçka kez gerektirir; hem hangisinin RNA bozulma teşvik ve transcriptome2,3alter bilinmektedir. Alternatif bir yaklaşım, LCM, daha güvenilir bir şekilde transcriptome korur ve RNA bütünlüğünü korur. Her ne kadar birçok araştırma-si olmak kullanılmış LCM gangliyon taze donmuş insan bağırsak dokusu4,5,6toplamak için bu yaklaşımlar ya zavallı RNA kalite ve miktar tarafından engel, oldukça emek yoğun, ya da boyama veya RNA ayıklama teknikleri bizim ellerimizde çalışmak için değişiklik gerekli. Ek geliştirmeler7,8, ama uyum ihtiyaç vardı enterik gangliyon8, yalıtım için uygulandığında kılavuzları sağlanan LCM ürün bulundu RNA korumak için tasarlanmış diğer LCM protokolleri 9. bu nedenle, o yüksek bütünlük RNA’ın önemli miktarlar insan enterik gangliyon verimleri, nispeten hızlı bir iş akışı olan ve büyük bir tutarlı sonuçlar bu kaynaklara göre en iyi duruma getirilmiş bir protokol geliştirdiğimiz örnekleri sayısı.
Bu çalışmada, enterik gangliyon rezeke insan bağırsak dokusundan kaynaklandığı gelen yüksek bütünlük RNA izolasyonu kolaylaştırmak en iyi duruma getirilmiş yordamlar bir özetini sunuyoruz. Bizim Yöntem beş önemli yönleri içerir. İlk, taze rezeke, sabitlenmemiş insan bağırsak örnekleri kesilmiş boyutu için bir laboratuvar doku ile kaldırıldı ve flash-dondurucu bir bulamaç Kuru buz ve 2-methylbutane (2 MB) üstüne önce büyük bir temel kalıp basık tüm aşırı nem. İkinci, histolojik kesitler bağırsak myenteric pleksus enterik gangliyon büyük bir yük sunmaktadır bir slaytta tam boyutunda elde etmek için hazırlanmalıdır. Başarı ile bu adım doku hazırlık süreci büyük ölçüde bağlıdır. Üçüncü olarak, ENS gangliyon nonuniform yapısını en büyük hız ve kesinlik LCM işlemi sırasında sunan polietilen napthalate (kalem) membran slaytlar6, kullanımını gerektirir. Dördüncü olarak, etanol uyumlu boya, kresil mor gibi enterik gangliyon boyama sırasında RNA bütünlüğünü korumak için kullanılır. Son, RNA ayıklama işlemi RNA-devamı ile başarılı bir sonuç için önemlidir Biz yüksek RNA bütünlük üretir, enterik gangliyon küçük koleksiyonları ile başlatma sırasında RNA verimi en üst düzeye çıkarır, DNA kirlenme ortadan kaldırır ve mümkün olduğunca çok sayıda RNA türler korur bir RNA ayıklama yaklaşım aradı.
Birlikte ele alındığında, mevcut çalışmada bu faktörlerin en iyi duruma getirme büyük ölçüde iş akışını hızlandırır ve olağanüstü RNA miktarı ve kalitesi ile enterik gangliyon örnekleri verir. Sonuçlar büyük ölçüde bu yaklaşım tutarlılığını gösteren örnekleri, oldukça büyük bir grup arasında tutarlı olmuştur. Ayrıca, başarılı bir şekilde enterik gangliyon RNA örnekleri onlarca sıralamak için bu yaklaşımlar kullandık. Burada vurgulanan stratejileri de genel olarak istenen gangliyon LCM veya periferik ve santral sinir sistemi ve yüksek kaliteli RNA izolasyonu gerektiren diğer durumlarda çekirdekleri gerçekleştirmek için adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çok sayıda enterik gangliyon verimli toplama RNA-devamı için RNA türetmek için bir kaynak olarak bu yordamla Burada, sonuna kadar RNA bütünlüğünü koruyarak varolan iletişim kuralları’nda belirtilen işlemler hız. Bu yordamdaki adımların tümünü birbirine bağlı olduğundan, tüm sorunları çalışma başlangıcından bertaraf edilmesi ve tüm örnekleri olarak benzer şekilde bir başkasına mümkün olduğunca güvenilir RNA-seq. elde etmek için hazır olduğundan önemlidir
<p class="jove_cont…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bağış ve bu iş mümkün kılan onların aileleri için minnettarız. Ayrıca Uluslararası Tıp Enstitüsü ve Tennessee donör Bu çalışmada kullanılan doku koordinat koleksiyonu yardım hizmetleri personeli yardım ederiz. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri, NIH OT2-OD023850 EMS2 ve nakit çekmek için gelen NIH T32-DK007673 AMZ için gelen hibe tarafından desteklenmiştir. Vanderbilt translasyonel patoloji paylaşılan kaynak personel için erişim okek enstrüman ve doku hazırlık tavsiyeler için minnettarız. Vanderbilt doku patoloji paylaşılan kaynak NIH hibe P30-CA068485-14 ve U24-DK059637-13 tarafından kısmen desteklenir. Genom teknoloji erişim merkezi Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi, genetik bölümü Genom Analizi ile yardım için teşekkür. GTAC ncı Kanser Merkezi Destek Grant #P30 CA91842 Siteman Kanser Merkezi için ve bit/CTSA Grant #UL1TR002345 Milli Merkezi tarafından kısmen desteklenen araştırma kaynakları (NCRR), ulusal kurumları sağlık (NIH) ve NIH bir bileşeni için Tıbbi araştırmalar için yol haritası. Bu yayın sadece yazarlar sorumludur ve mutlaka NCRR veya NIH resmi görünümünü temsil etmiyor.
Materials
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
- Gershon, M. D. . The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- . PALM Protocols – RNA handling Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011)
- . Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015)
- . Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3′ tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W. Laser capture. Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
