시 냅 스에서 사이클링 하는 FM 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 Channelrhodopsin 자극을 비교

요약

시 냅 스 소포 (SV) 자전거는 신경 시 냅 스에서 세포 커뮤니케이션의 핵심 메커니즘. FM 염료 통풍 관 및 릴리스 양적 SV 엔도-및 exocytosis 시 금의 기본 수단입니다. 여기, 우리는 모든 자극 방법 FM1 43 초파리 신경 근육 학 교차로 (NMJ) 모델 시 냅 스에서 자전거를 비교 합니다.

초록

FM 염료는 시 냅 스 소포 (SV) 주기를 공부 하는 데 사용 됩니다. 이러한 amphipathic 프로브는 친수성 머리와 소수 성 꼬리, 수용 성 역 입력 하 고 종료 막 지질 bilayers 능력 들을 만들고 있다. 이러한 styryl 염료는 상대적으로 비-형광 수성 매체에 있지만 원형질 막의 외부 전단에 삽입 한 > 형광 40 X 증가. 신경 시 냅 스에서 FM 염료는 SV endocytosis, 매매 모두 시간과 SV 풀 사이 함께 출시 된 SV exocytosis neurotransmission의 연 접 단계를 시각화 하는 강력한 도구를 제공 하는 동안 내 면. Glutamatergic 냅 개발 및 기능의 기본 유전자 모델은 Drosophila 신경 근육 학 교차로 (NMJ), FM 영상을 염색 SV 역학 돌연변이 조건의 넓은 범위에서 계량을 광범위 하 게 사용 되었습니다. NMJ 시 냅 스 터미널은, 아름 다운 배열의 큰 시 냅 스 boutons 이미징 응용 프로그램에 적합 합니다. 여기, 우리가 비교와 초파리 NMJ 활동 종속 FM1 43 염료 글귀/릴리스를 자극 하는 세 가지 방법으로 대조: 높은 [⁺K] 신경 근육 학 조직 depolarize, 2) 흡입 전극 모터 신경의 응용 프로그램 1) 목욕 연 접 신경 맨끝, 및 3 depolarize를 자극) 대상의 도발은 빛 자극, 공간 제어를 위한 channelrhodopsin 이체의 유전자 변형 식. 이러한 메서드의 마다 장점과 단점 SV 주기 유전자 변이 효과의 연구에 대 한 초파리 NMJ에. 우리는 이러한 장점과 단점 각 전략을 구체적인 방법론을 함께 자극 방식의 선택에 도움을 논의할 예정 이다. 형광 이미징, 뿐만 아니라 FM 염료 ultrastructural 수준에서 SV 사이클 메커니즘 연구를 전송 전자 현미경 (TEM)을 사용 하 여 시각화 하는 전자 밀도 신호를 photoconverted 수 있습니다. 우리 confocal의 비교를 제공 하 고 전자 현미경 이미징 도움말 가이드에 초파리 NMJ 자극의 다른 방법에서 미래 실험 패러다임의 선택.

서론

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로 (NMJ) glutamatergic 냅 모델 아름 답게 특징은 시 냅 스 형성 유전자 섭¹의 광대 한 스펙트럼과 기능을 공부 하 고 사용 되었습니다. 여러 축 삭 분 지, 각각 많은 확대 시 냅 스 boutons 모터 신경 맨끝에 의하여 이루어져 있다. 이 널찍한 varicosities (최대 5 µ m 직경에서) neurotransmission 기계, 균일 한 glutamatergic 시 냅 스 소포를 포함 하 여 모든 포함 (SVs; ~ 40 nm 직경에서) cytosolic 예비에 쉽게 releasable 풀². 이 소포는 연 접 원형질 막 퓨전 사이트 활성 영역 (AZs), 어디 exocytosis 트랜스에 대 한 조미료 신경 전달 물질 방출을 중재에 도킹-시 냅 스 통신. 그 후, SVs는 반복된 엑 소/endocytosis 사이클 키스 실행 재활용 또는 clathrin 중재 된 endocytosis (CME)를 통해 원형질 막에서 검색 됩니다. Drosophila NMJ은 쉽게 접근 가능 하 고 모두 분리 및 SV 주기 돌연변이 적합. 앞으로 유전 스크린을 사용 하 여, 새로운 돌연변이 SV 사이클

프로토콜

1. 애벌레 접착제 해 부

1. 철저 하 게 혼합 실리콘 탄성 엘라 스토 머 키트 (자료 테이블)에서 에이전트를 경화 실리콘 탄성 중합체의 1 부분으로 기본의 10 개 부분.
2. 몇 시간 (때까지 더 이상 터치 스티커)에 대 한 탄성 중합체와 75 ˚C에서 뜨거운 접시에 치료 22 x 22 m m 유리 coverslips 코트.
3. 단일 탄성 중합체 코팅 유리 coverslip을 애벌레 해 부에 대 한 준비에 맞춤 plexi 유리 절 개 챔버 (그림 1, 하단)에 넣으십시오.
4. 표준 microelectrode 끌어당기는 사람을 사용 하 여 원하는 테이퍼 팁 크기를 붕 규 산 유리 모 세관에서 접착제 펫을 준비 합니다.
5. 부드럽게 micropipette 팁 오프 하 고 다른 쪽 끝을, 유연한 플라스틱 튜브 (1/32"내부 직경, ID 3/32" 외부 직경, OD, 1/32"벽;의 2 피트 자료의 테이블) 와 입 (P2 피 펫 팁) 피팅.
6. 애벌레 해 부에 대 한 준비에 접착제 (자료 테이블)의 작은 양 (~ 20 µ L)으로 작은 컨테이너 (0.6 mL Eppen....

결과

그림 1 프로토콜 이미징 활동 종속 FM 염료에 대 한 작업 흐름을 보여 줍니다. 실험은 항상 이후에 사용 되는 자극 방법에 관계 없이 같은 애벌레 접착제 해 부로 시작 합니다. 그림 1a 보여주는 복 부 신경 코드 (VNC), 신경 및 반복된 hemisegmental 근육 패턴을 발산 해 부 유 충의 회로도 이다. VNC 제거 되 고 준비 FM1-43 (그림 1b, 핑크)의 4 µ M 솔루션에 목욕. 준비는 다음 활동 종속 SV endocytosis (그림 1cI-III) 통해 염료를 로드 하는 세 가지 가능한 옵션 중 하나를 사용 하 여 FM 염료의 자극. 다음, FM 염료 사용 하 여 Ca^{2 +}체포 사이클.......

토론

높은 [K⁺] 염 분 depolarizing 자극은 훨씬 활동 종속 FM 염료 사이클링, 하지만 가능성이 적어도 생리²⁹에 대 한 세 가지 옵션의 쉬운. 이 간단한 방법은 모든 액세스할 수 셀 전체 동물에 depolarizes 하 고 그래서 감독된 연구를 허용 하지 않습니다. 로컬로 micropipette와 높은 [K⁺] 염 분을 적용 하는 것만이 여전히 사전/postsynaptic 세포와 시 냅 스 연결 가능성이 명과¹depolarize 것입니다. 또 다른 주요 관심사는 그 높은 [K⁺] 도발은 드라이브 빠른 형성의 대량 endosomes 거의 unstimulated boutons에서 볼 수 있습니다. 그러나, 대량 endosome 형성 변이²⁹, 진짜 생리 적인 과정을 나타내는 의해 차단 하는 활성 메커니즘입니다. 따라서, 높은 [K

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SylGard 184 실리콘 엘라스토머 키트	Fisher Scientific	NC9644388	해부용 커버 유리
커버 유리 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	해부용 SylGard
알루미늄 상단 핫 플레이트 유형 2200	Thermolyne	HPA2235M	SylGard
플렉시 유리 해부 챔버	경화 N/A	N/	A 핸드메이드
붕규산 유리 모세 필러리	WPI	1B100F-4	흡입 및 접착제 마이크로 피
만들기 레이저 기반 마이크로 피펫 풀러	셔터 기기	P-2000	흡입 및 접착제 마이크로 피펫 만들기
Tygon E-3603 Laboratory Tubing	Component Supply Co.	TET-031A	구강 및 흡입 피펫용
P2 피펫 팁	USA Scientific	1111-3700	구강 피펫용
0.6-mL Eppendorf 튜브 캡	Fisher Scientific	05-408-120	해부용 접착제 투
Vetbond 3M	WPI	베트본드	해부에 사용되는 접착제
염화칼	Fisher Scientific	P-217	Forsaline
염화나트륨	Millipore Sigma	S5886	식염
염화 마그네슘	Fisher Scientific	M35-500	식염
칼슘 염화물 이수화물	Millipore	Sigma C7902	염수
자	Fisher Scientific	S5-3	식염수
HEPES	Millipore Sigma	H3375	식염수
HRP : Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	신경 세포막 라벨링
Paintbrush	Winsor & Newton	94376864793	유충을 조작하기 위해
Dumont Dumostar 핀셋 #5	WPI	500233	해부 중 사용
7cm McPherson-Vannas Microscissors(블레이드 3mm)	WPI	14177	해부 중 사용
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	형광 스티릴 염료
디지털 타이머	VWR	62344-641	FM 염료 로드/언로드 타이밍용
LSM 510 META 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경	Zeiss		형광 마커 이미징
Zen 2009 SP2 버전 6.0	Zeiss		소프트웨어 컨포칼
HeNe 633nm 레이저	Lasos		이미징 중 HRP : 647 Argon
488nm 레이저	Lasos		이미징 중 FM 염료 여기
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LED 470nm	ThorLabs	M470L2	ChR 활성화에 사용
T-Cube LED 드라이버	ThorLabs	LEDD1B	LED
전원 공급 장치	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	에 전원을 공급하려면
	ThorLabs	PM100D	LED 강도를 측정합니다

현미경 착용 펫 입 륨 수 수 식당 를 제어하려면 LED 광 전력 및 에너지 미터.