फ़ैगोसाइट में Intracellular प्रतिकृतिकरण के लिए माइकोबैक्टीरियम abscessus के डाह मार्करों की पहचान
Summary
यहां, हम Phagocyte-माइकोबैक्टीरियम abscessus बातचीत का अध्ययन करने के लिए दो प्रोटोकॉल पेश: बैक्टीरियल intracellular की कमी और आरएनए से बैक्टीरियल intracellular transcriptome के निर्धारण के लिए एक transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय की स्क्रीनिंग Sequencing. दोनों दृष्टिकोण जीनोमिक लाभ और transcriptomic रूपांतरों intracellular बैक्टीरिया फिटनेस बढ़ाने में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं ।
Abstract
क्या दूसरे saprophytic आइसोलेटों से माइकोबैक्टीरियम abscessus अंतर मानव phagocytosis द्वारा मैक्रोफेज और ऐसी कोशिकाओं के अंदर गुणा करने की क्षमता का विरोध करने की क्षमता है । ये डाह लक्षण विशेष रूप से अंतर्निहित संरचनात्मक फेफड़ों की बीमारी, जैसे सिस्टिक फाइब्रोसिस, bronchiectasis या तपेदिक के साथ कमजोर मेजबान में, एम abscessus रोगजनक प्रदान करते हैं । कैसे रोगियों एम. abscessus के साथ संक्रमित हो जाता है अस्पष्ट बनी हुई है । कई आइसोलेटों के विपरीत, m. abscessus वातावरण में नहीं मिला है, लेकिन amoebae के अंदर रहते हैं, पर्यावरण फ़ैगोसाइट कि एम abscessusके लिए एक संभावित जलाशय का प्रतिनिधित्व हो सकता है । दरअसल, m. abscessus amoebal phagocytosis के लिए प्रतिरोधी है और इंट्रा अमीबा जीवन संक्रमण के एक प्रयोगात्मक मॉडल में एम abscessus डाह को बढ़ाने के लिए लगता है । हालांकि, लिटिल अपने आप में एम abscessus डाह के बारे में जाना जाता है । एम. abscessus intracellular जीवन, एक एम. abscessus transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय की स्क्रीनिंग के लिए एक लाभ प्रदान जीन समझने के लिए विकसित किया गया था । समानांतर में, amoebae के साथ सह संस्कृति के बाद intracellular आइसोलेटों से आरएनए निष्कर्षण का एक तरीका विकसित किया गया था । इस विधि को मांय किया गया था और कक्षों के अंदर पूरे M. abscessus transcriptomes के sequencing की अनुमति है; प्रदान, पहली बार के लिए, intracellular जीवन के लिए एम abscessus अनुकूलन पर एक वैश्विक दृष्टिकोण । दोनों दृष्टिकोण हमें एम. abscessus डाह कारकों में एक अंतर्दृष्टि दे कि एम. abscessus सक्षम करने के लिए मानव में एयरवेज उपनिवेश ।
Introduction
जीनस माइकोबैक्टीरियम प्रमुख मानव रोगजनकों के लिए हानिरहित saprophytic जीवों से लेकर प्रजातियों में शामिल हैं । माइकोबैक्टीरियम तपेदिक, माइकोबैक्टीरियम marinum और माइकोबैक्टीरियम ulcerans के रूप में अच्छी तरह से ज्ञात रोगजनक प्रजातियों धीमी गति से बढ़ते आइसोलेटों (SGM) के उपसमूह के हैं । इसके विपरीत, तेजी से बढ़ते आइसोलेटों (RGM) के उपसमूह में आगर माध्यम पर 7 दिनों से भी कम समय में दिखाई देने वाली कॉलोनियों के रूप में उनकी क्षमता की विशेषता है । RGM समूह में १८० से अधिक प्रजातियों, मुख्यतः गैर रोगजनक saprophytic आइसोलेटों शामिल हैं । उनके मेजबानों के साथ RGM बातचीत पर अध्ययन मुख्य रूप से माइकोबैक्टीरियम smegmatis पर केंद्रित है और यह प्रदर्शित करता है कि इन आइसोलेटों तेजी से जीवाणुनाशक की मैक्रोफेज कार्रवाई से सफाया कर रहे हैं ।
माइकोबैक्टीरियम abscessus दुर्लभ RGM है कि मनुष्यों के लिए रोगजनक है और त्वचा और कोमल ऊतक संक्रमण से फेफड़े और प्रसार संक्रमण से लेकर संक्रमण की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए जिंमेदार है में से एक है । M. abscessus माना जाता है, माइकोबैक्टीरियम एवियमके साथ, सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों1में मुख्य माइक्रोबैक्टीरियल रोगज़नक़ हो ।
एम abscessus पर प्रदर्शन किया विभिंन अध्ययनों से संकेत मिलता है कि इस माइकोबैक्टीरियम एक intracellular रोगज़नक़ की तरह व्यवहार करता है, मैक्रोफेज और फेफड़ों और त्वचा में fibroblasts, जो आम तौर पर RGM में नहीं मनाया जाता है की जीवाणुनाशक प्रतिक्रिया जीवित करने में सक्षम 2 , 3 , 4. M. abscessus जीनोम विश्लेषण आम तौर पर मिट्टी, पौधों और जलीय वातावरण, जहां मुक्त amoebae अक्सर5उपस्थित है के साथ संपर्क में पर्यावरण सूक्ष्मजीवों में पाया चयापचय रास्ते की पहचान की है । उंहोंने यह भी दिखा दिया है कि एम abscessus कई डाह saprophytic और गैर में पाया जीन नहीं रोगजनक RGM, शायद एक आनुवंशिक मुद्रा है कि इकट्ठा हो सकता है के लिए अनुकूल आला में क्षैतिज जीन हस्तांतरण द्वारा अधिग्रहीत के साथ संपंन है विभिन्न अमीबा प्रतिरोधी बैक्टीरिया ।
प्रायोगिक तौर पर, पहले हड़ताली परिणामों में से एक मैक्रोफेज में एम. abscessus के intracellular वृद्धि के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में एम तपेदिक6के लिए निरीक्षण किया गया । एम abscessus भी phagosome, apoptosis और autophagy,2संक्रमण के लिए सेलुलर प्रतिरोध के तीन आवश्यक तंत्र के अंलीकरण का विरोध करती है । यह भी दिखाया गया है कि एम abscessus phagosome और cytosol के बीच एक तत्काल संचार स्थापित करने में सक्षम है, एक अधिक पोषक तत्वों युक्त वातावरण है कि जीवाणु गुणन2एहसान हो सकता है । बहुत कम जीनोमिक फायदे के बारे में जाना जाता है कि एम abscessus के पास या एक intracellular वातावरण में अस्तित्व की अनुमति हासिल कर ली है । अमीबा coculture एक कुशल तरीका है कि माइकोबैक्टीरियम massiliense7,8के रूप में कई नए अमीबा प्रतिरोधी बैक्टीरिया के अलगाव की अनुमति दी है । एक क्षमता amoebae भीतर गुणा करने के लिए देखा गया था, चूहों में एम abscessus के aerosolization के एक मॉडल में, जो एम abscessus4के लिए एक वृद्धि की डाह प्रदान कर सकते हैं. एक परिकल्पना है कि एम abscessus आनुवंशिक इस वातावरण के भीतर का सामना करना पड़ा phagocytic कोशिकाओं है, जो अंय गैर रोगजनक RGM से अलग है में जीवित लक्षण विकसित किया था । इन अधिग्रहणों और मानव की मेजबानी में अपनी डाह प्रसार करने की क्षमता एहसान हो सकता है ।
इस रिपोर्ट में amoebae वातावरण में जीवित रहने के लिए M. abscessus को प्रदत्त जीनोमिक लाभों को हाइलाइट करने के लिए उपकरण और विधियों का वर्णन किया गया है । इस प्रयोजन के लिए, एम abscessus transposon म्यूटेंट की स्क्रीनिंग पहले, Acanthamoeba castellanii प्रकार तनाव है, जो intracellular विकास के लिए है उत्परिवर्ती दोषपूर्ण की पहचान की अनुमति देता है पर वर्णित है । मैक्रोफेज में एक दूसरी स्क्रीनिंग भी बताया जाता है, की पुष्टि करने के लिए यदि यह दोष मानव की मेजबानी में बनी हुई है । दूसरे, समझने के लिए जो तंत्र abscessus में दोहन करने के लिए phagocytic कोशिकाओं में जीवन के लिए अनुकूल है और पशु मेजबान में अपनी डाह वृद्धि, एक विधि विशेष रूप से एम abscessus के लिए अनुकूल विकसित किया गया था, सह के बाद संस्कृति amoebae की उपस्थिति है कि इंट्रा amoebal बैक्टीरिया से कुल आरएनए के निष्कर्षण की अनुमति दी । एक परिणाम के रूप में, एम abscessus जीन है कि एक intracellular जीवन के लिए आवश्यक है की एक व्यापक दृष्टिकोण विकसित किया गया था ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एम. abscessus के व्यवहार अधिक है जैसे कि किसी भी अन्य आइसोलेटों से संबंधित RGM2के अलावा रोगजनक SGM के व्यवहार के समान है । SGM के pathogenicity में प्रमुख तत्व उनके जीवित रहने या भी प्रतिजन के भीतर गुणा-कोशिका…
Acknowledgements
हम बहुत पीआर E.J. रुबिना (हार्वर्ड मेडिकल स्कूल, बोस्टन, संयुक्त राज्य अमेरिका) उत्परिवर्ती पुस्तकालय के कीमती उपहार के लिए स्वीकार करते हैं, और डॉ बेन मार्शल (चिकित्सा, साउथेंप्टन, ब्रिटेन के विश्वविद्यालय के संकाय) पांडुलिपि के सुधार के लिए । हम बहुत सिस्टिक फाइब्रोसिस के लिए फ्रेंच रोगी एसोसिएशन स्वीकार “Vaincre ला Mucoviscidose” और “L’Association ग्रेगरी Lemarchal” उनके वित्तीय सहायता (RF20150501377) के लिए । हम नेशनल एजेंसी फॉर रिसर्च (ANR प्रोग्राम DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)), और वी. एल-एम को Région फेलोशिप की फंडिंग के लिए d’Intérêt इले-डे-फ्रांस (domaine Majeur विकृतियों Infectieuses postdoctoral एट आपाती) का भी शुक्रिया अदा करते हैं । एल. एल. “Ministère डे L’Enseignement Supérieur एट डे ला सभ्य” से डॉक्टरेट की फेलो हैं ।
Materials
| Name of Material/ Equipment | |||
| 24-well plates | Thermofisher | 11874235 | |
| 96-well plates | Thermofisher | 10687551 | |
| Beadbeater | Bertin | Precellys 24 | |
| Bioanalyzer | Agilent | ||
| Genepulser Xcell | Biorad | ||
| Nanodrop spectrophotometer 2000 | Thermofisher | ||
| QuBit fluorometer | Thermofisher | Q33226 | |
| zirconium beads/silica beads | Biospec products | 11079101Z | Beads |
| Name of reagent/cells | |||
| Acanthamoeba castellanii | ATCC | 30010 | strain |
| Amikacin | Mylan | 150927-A | powder |
| B-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | >93% granular anhydrous |
| Chloroform | Fluka | 25666 | solution |
| ClaI enzyme | New England Biolabs | R0197S | enzyme |
| Columbia agar | Biomerieux | 43041 | 90 mm |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | powder |
| DMEM | Thermofisher | 11500596 | medium |
| DNase and RNase free water | Invitrogen | 10977-035 | solution |
| E. coli electrocompetent | Thermofisher | 18265017 | bacteria |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | powder |
| Escherichia coli | Clinical isolate | personal stock | bacteria |
| Fe(NH4)2(SO4)-6H20 | EMS | 15505-40 | sulfate solution 4% aqueous |
| Fetal Calf Serum | Gibco | 10270 | serum |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | solution |
| Guanidium thiocyanate | Euromedex | EU0046-D | powder |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | solution |
| J774.2 macrophages | Sigma-Aldrich | J774.2 | Strain |
| kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | powder |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Monobasic, anhydrous |
| LB liquid medium | Invitrogen | 12795-027 | powder |
| Lysozyme | Roche | 10837059001 | powder |
| MgSO4 | Labosi | M275 | pur |
| Microbank TM (cryotubes with beads) | Pro-Lab Diagnostic | PL.170/M | |
| Middlebrook 7H11 medium | Sigma-Aldrich | M0428 | powder |
| Middlebrook 7H9 medium | Thermofisher | 11753473 | powder |
| Müller-Hinton agar | Biorad | 3563901 | powder |
| N-Lauryl-sarcosine | Merck | S37700 416 | powder |
| Na2HPO4-7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 98-102% |
| Phenol/chloroforme | Sigma-Aldrich | 77617 | solution |
| Proteinase K | Thermofisher | EO0491 | powder |
| proteose peptone | BD | 211684 | enzymatic digest of animal tissue |
| pUC19 plasmid | New England Biolabs | 54357 | plasmid |
| SDS 20% | Biorad | 1610418 | solution |
| Sodium citrate | Calbiochem | 567446 | powder |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | 88810 | powder |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | powder |
| Trizol | Thermofisher | 12044977 | solution |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | solution |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Kit | |||
| AMBION DNase kit | Thermofisher | 10792877 | kit |
| DNA Agilent Chip | Agilent | 5067-1504 | kit |
| GeneJET Plasmid Miniprep kit | Thermofisher | K0503 | kit |
| PureLink PCR Purification kit | Invitrogen | K310001 | kit |
| Quant-It" assays kit | Thermofisher | Q33140/Q32884 | kit |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | Y90001 | kit |
| TruSeq Stranded RNA LT prep kit | Illumina | 15032611 | kit |
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