Identifiering av virulens markörer för Mycobacterium abscessus för intracellulär replikering i fagocyter
Summary
Här presenterar vi två protokoll för att studera fagocytsystemet –Mycobacterium abscessus interaktioner: screening av transposon mutant bibliotek för bakteriell intracellulär brist och bestämning av bakteriell intracellulära transkriptom från RNA sekvensering. Båda tillvägagångssätten ger insikt om genomisk fördelar och transcriptomic anpassningar öka intracellulära bakterier fitness.
Abstract
Vad skiljer Mycobacterium abscessus från andra saprofytiska mykobakterier är förmågan att motstå fagocytos av mänskliga makrofager och förmågan att föröka sig inuti sådana celler. Dessa virulens drag återge M. abscessus patogena, särskilt i utsatta värdar med underliggande strukturella lungsjukdom, exempelvis cystisk fibros, bronkiektasi eller tuberkulos. Hur patienter smittas med M. abscessus oklar. Till skillnad från många mykobakterier, M. abscessus finns inte i miljön men kan finnas inuti endoparasiterna, miljömässiga fagocyter som representerar en potentiella reservoar för M. abscessus. Faktiskt, M. abscessus är resistent mot amoebal fagocytos och intra-amoeba livet verkar öka M. abscessus virulens i en experimentell modell av infektion. Men är lite känt om M. abscessus virulens i sig själv. För att dechiffrera de gener som ger en fördel till M. abscessus intracellulära liv, utvecklades en screening av M. abscessus transposon mutant bibliotek. Parallellt utvecklades en metod för RNA-extraktion från intracellulära mykobakterier efter samtidig kultur med endoparasiterna. Denna metod var validerad och tillät sekvensering av hela M. abscessus transcriptomes inne i cellerna; att ge, för första gången, en global syn på M. abscessus anpassning till intracellulära liv. Båda tillvägagångssätten ger oss en inblick i M. abscessus virulensfaktorer som möjliggör M. abscessus att kolonisera luftvägarna hos människa.
Introduction
Släktet Mycobacterium omfattar arter allt från ofarliga saprofytiska organismer till stora mänskliga patogener. Välkända sjukdomsframkallande arter som Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum och Mycobacterium ulcerans tillhör undergruppen av långsamt växande mykobakterier (SGM). I kontrast, undergruppen av snabbt växande mykobakterier (RGM) kännetecknas av deras förmåga att bilda synliga kolonier i mindre än 7 dagar på agarsubstrat. RGM gruppen består av mer än 180 arter, främst icke-patogena saprofytiska mykobakterier. Studier på RGM interaktioner med sina värdar har främst fokuserat på Mycobacterium smegmatis och visar att dessa mykobakterier elimineras snabbt av den bakteriedödande effekten av makrofager.
Mycobacterium abscessus är en av de sällsynta RGM som är patogen för människor och ansvarar för ett brett spektrum av infektioner alltifrån hud och mjukdelsinfektioner till lung- och disseminerad infektioner. M. abscessus anses, tillsammans med Mycobacterium avium, huvudsakliga mykobakteriella patogenet i cystisk fibros patienter1.
Olika studier utförs på M. abscessus indikerar att denna mycobacterium beter sig som en intracellulära patogener, kan överleva den bakteriedödande Svaren av makrofager och fibroblaster i lungorna och huden, som inte vanligtvis observeras i RGM 2 , 3 , 4. M. abscessus genomanalys har identifierat metabolismvägarna som normalt återfinns i miljön mikroorganismer i kontakt med jorden, växter och vattenmiljöer, där gratis endoparasiterna är ofta närvarande5. De har också visat att M. abscessus är begåvad med flera virulensgener som inte finns i den saprofytiska och icke-patogena RGM, troligen förvärvats av den horisontell genöverföring i en nisch som är gynnsam till genetisk utbyte som kan samla olika amöba resistenta bakterier.
Experimentellt, var en av de första slående resultaten observationen av intracellulära tillväxten av M. abscessus i makrofager samt när det gäller M. tuberculosis6. M. abscessus motstår också försurning av phagosome, apoptos och autofagi, tre grundläggande mekanismer av cellulära motståndet till infektion2. Det har även visat att M. abscessus ska kunna upprätta en omedelbar kommunikation mellan phagosome och cytosolen, en mer näringsrik miljö som kan gynna bakteriell multiplikation2. Mycket lite är känt om genomisk fördelarna som M. abscessus äger eller har förvärvat för att möjliggöra överlevnad i en intracellulär miljö. Amöba coculture är en effektiv metod som tillåtna isoleringen av många nya amöba resistenta bakterier som Mycobacterium massiliense7,8. En förmåga att föröka sig inom endoparasiterna observerades, i en modell av aerosolization av M. abscessus i möss, som kan ge en ökad virulens M. abscessus4. En hypotes är att M. abscessus hade utvecklat genetiska egenskaper som uppstått inom denna miljö att överleva i Fagocytos celler, som skiljer sig från andra icke-patogena RGM. Dessa förvärv kan gynna möjligheten att sprida och dess virulens i den mänskliga värden.
Denna rapport beskriver verktyg och metoder att markera genomisk fördelar som är knutna till M. abscessus att överleva i endoparasiterna miljö. För detta ändamål beskrivs screening av M. abscessus transposon mutanter först på Acanthamoeba castellanii typ stam, som möjliggör identifiering av mutant’s defekt intracellulära tillväxt. En andra sållning i makrofager rapporteras också, att bekräfta om detta fel kvarstår i den mänskliga värden. För det andra, utvecklat celler och öka dess virulens i djurens värd, en metod som speciellt anpassad för M. abscessus var för att förstå vilka mekanismer är utnyttjas i M. abscessus att anpassa sig till livet i fagocytos, efter samtidig kultur i närvaro av endoparasiterna som tillät utvinning av total-RNA från intra-amoebal bakterier. Som en följd utvecklades en helhetssyn av M. abscessus gener som krävs för en intracellulär liv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beteendet hos M. abscessus är mycket mer liknar beteendet hos patogena SGM såsom M. tuberkulos än alla andra mykobakterier som tillhör RGM2. Nyckelelement i patogenicitet av SGM är deras förmåga att överleva eller ens multiplicera inom antigen-presenterande celler, såsom makrofager och dendritiska celler.
M. abscessus har förvärvat vissa genomisk fördelar som visas av den totala sekvensen av dess arvsmassa14…
Acknowledgements
Vi erkänner kraftigt Pr. E.J. Rubin (Harvard Medical School, Boston, USA) för dyrbara gåva muterade bibliotek och Dr. Ben Marshall (medicinska fakulteten, University of Southampton, UK) för korrigeringar av manuskriptet. Vi erkänner kraftigt franska patienten föreningen för cystisk fibros ”Vaincre la Mucoviscidose” och ”L’Association Gregory Lemarchal” för deras finansiella stöd (RF20150501377). Vi tackar också den nationella byrån för forskning (ANR program DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) och de Région Ile-de-France (Domaine d’Intérêt majeure Maladies Infectieuses et Emergentes) för finansiering av postdoktorsstipendium till Smootie_-M. L. L. är en doctoral fellow från den ”Ministère de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | |||
| 24-well plates | Thermofisher | 11874235 | |
| 96-well plates | Thermofisher | 10687551 | |
| Beadbeater | Bertin | Precellys 24 | |
| Bioanalyzer | Agilent | ||
| Genepulser Xcell | Biorad | ||
| Nanodrop spectrophotometer 2000 | Thermofisher | ||
| QuBit fluorometer | Thermofisher | Q33226 | |
| zirconium beads/silica beads | Biospec products | 11079101Z | Beads |
| Name of reagent/cells | |||
| Acanthamoeba castellanii | ATCC | 30010 | strain |
| Amikacin | Mylan | 150927-A | powder |
| B-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | >93% granular anhydrous |
| Chloroform | Fluka | 25666 | solution |
| ClaI enzyme | New England Biolabs | R0197S | enzyme |
| Columbia agar | Biomerieux | 43041 | 90 mm |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | powder |
| DMEM | Thermofisher | 11500596 | medium |
| DNase and RNase free water | Invitrogen | 10977-035 | solution |
| E. coli electrocompetent | Thermofisher | 18265017 | bacteria |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | powder |
| Escherichia coli | Clinical isolate | personal stock | bacteria |
| Fe(NH4)2(SO4)-6H20 | EMS | 15505-40 | sulfate solution 4% aqueous |
| Fetal Calf Serum | Gibco | 10270 | serum |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | solution |
| Guanidium thiocyanate | Euromedex | EU0046-D | powder |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | solution |
| J774.2 macrophages | Sigma-Aldrich | J774.2 | Strain |
| kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | powder |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Monobasic, anhydrous |
| LB liquid medium | Invitrogen | 12795-027 | powder |
| Lysozyme | Roche | 10837059001 | powder |
| MgSO4 | Labosi | M275 | pur |
| Microbank TM (cryotubes with beads) | Pro-Lab Diagnostic | PL.170/M | |
| Middlebrook 7H11 medium | Sigma-Aldrich | M0428 | powder |
| Middlebrook 7H9 medium | Thermofisher | 11753473 | powder |
| Müller-Hinton agar | Biorad | 3563901 | powder |
| N-Lauryl-sarcosine | Merck | S37700 416 | powder |
| Na2HPO4-7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 98-102% |
| Phenol/chloroforme | Sigma-Aldrich | 77617 | solution |
| Proteinase K | Thermofisher | EO0491 | powder |
| proteose peptone | BD | 211684 | enzymatic digest of animal tissue |
| pUC19 plasmid | New England Biolabs | 54357 | plasmid |
| SDS 20% | Biorad | 1610418 | solution |
| Sodium citrate | Calbiochem | 567446 | powder |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | 88810 | powder |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | powder |
| Trizol | Thermofisher | 12044977 | solution |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | solution |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Kit | |||
| AMBION DNase kit | Thermofisher | 10792877 | kit |
| DNA Agilent Chip | Agilent | 5067-1504 | kit |
| GeneJET Plasmid Miniprep kit | Thermofisher | K0503 | kit |
| PureLink PCR Purification kit | Invitrogen | K310001 | kit |
| Quant-It" assays kit | Thermofisher | Q33140/Q32884 | kit |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | Y90001 | kit |
| TruSeq Stranded RNA LT prep kit | Illumina | 15032611 | kit |
References
- Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
- Roux, A. -. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
- Bakala N’Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
- Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
- Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of “Mycobacterium massiliense” sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
- Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
- Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
- Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
- Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
- Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
- Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
- Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
- Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii – Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834 (2014).
- Thomas, V., Loret, J. -. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
- Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
- Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
- Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, 246-258 (2011).
- Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121 (2017).
- Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939 (2018).
- Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
- Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
- Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
- Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
- Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
- Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
- Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
- Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).
