Summary

לכימות ויבריו cholerae קולוניזציה ושלשולים במודל דג זברה למבוגרים

Published: July 12, 2018
doi:

Summary

דג זברה הם טבעיים ויבריו cholerae לארח והוא יכול לשמש מסכם את הדברים וללמוד כל מחזור זיהומיות של קולוניזציה שידור. כאן, אנחנו מדגימים כיצד להעריך נ’ cholerae קולוניזציה רמות ולכמת שלשול אצל דג זברה.

Abstract

ויבריו cholerae ידועה בתור הסוכן זיהומיות הגורמת הכולירע מחלות אנושיות. בחוץ הפונדקאי. האנושי, נ’ cholerae בעיקר קיימת בסביבה המימית, איפה זה מקיים אינטראקציה עם מגוון מינים ימיים גבוה יותר. דגים חוליות ידועים להיות מארח הסביבה והם פוטנציאל נ’ cholerae מאגר בטבע. גם נ’ cholerae וגם מיני דגים teleost רזבורה rerio, הידוע בכינויו דג זברה, מקורן היבשת ההודית, רומז על אינטראקציה ארוכת שנים בסביבות מימיות. דג זברה הם אורגניזם מודל אידיאלי ללמוד היבטים רבים של ביולוגיה, כולל מחלות זיהומיות. דג זברה יכול בקלות, במהירות קולוניה נ’ cholerae לאחר חשיפה במים. קולוניזציה מעיים מאת נ’ cholerae מוביל את הייצור של שלשול הפרשה של משוכפלים נ’ cholerae. אלה מופרש חיידקים יכולים אז קדימה ליישב פונדקאים חדשים של דגים. כאן, אנחנו מדגימים כיצד להעריך נ’ cholerae-קולוניזציה מעיים דג זברה ואיך לכמת נ’ cholerae-induced דג זברה שלשול. המודל קולוניזציה צריך להועיל לחוקרים הלומדים אם הגנים של עניין עשוי להיות חשוב עבור המארח קולוניזציה ו/או להישרדות סביבתיים. כימות של דג זברה שלשול צריך להיות שימושי החוקרים ללמוד כל פתוגן מעיים המעוניינים לחקור את דג זברה כמערכת מודל.

Introduction

ויבריו cholerae הוא חיידק הימית, גראם שליליים, הגורמת של מחלות אנושיות כולרה, כמו גם שלשול נמשך “טפטוף”1,2. (פ’) cholerae נמצא בסביבה בתחומים רבים של העולם, קשורה לעיתים קרובות עם אורגניזמים ימיים אחרים. אורגניזמים שיוך אלה כוללים פלנקטון, ביצה חרקים ההמונים, רכיכה חוליות דגים מינים3,4,5,6,7. מספר מחקרים שללו נ’ cholerae מ ספינלי מעיים של דגים ב אזורים גאוגרפיים שונים7,8,9,10. הנוכחות של נ’ cholerae בדגים מציין כי דגים עשוי לפעול כמו מאגר הסביבה. גם יכול להיות מעורב דגים בהעברת המחלה לבני, פיזור גיאוגרפי נ’ cholerae זנים6.

כדי להבין טוב יותר איך נ’ cholerae אינטראקציה עם דגים, רזבורה rerio, הידועה יותר בשם דג זברה, פותחה כמערכת מודל לימוד נגד כולרהe11. דג זברה הם ילידי דרום אסיה, כולל באזור מפרץ בנגל, אשר נחשב מאגר המוקדם של נ’ cholerae. עד הראשון כולרה מגיפה בשנת 1817, כולרה לא דווח כי מחוץ מה שעכשיו הודו ובנגלדש. לכן, דג זברה, נ’ cholerae כמעט בוודאות הקשורים אחד לשני על סולמות אבולוציוני, רומז כי דג זברה הם שורה נ’ cholerae הסביבה הטבעית12.

דג זברה המודל נ’ cholerae פשוטה לביצוע והוא יכול לשמש כדי לחקור את כל פתוגניים נ’ cholerae מחזור החיים. דגים נחשפים נ’ cholerae על ידי רחצה במים אשר חיסנה עם מספר ידוע של נ’ cholerae. בתוך מספר שעות, קולוניזציה מעיים מתקיים, ואחריו את הייצור של שלשול. שלשול מורכב mucin, חלבונים, החיידקים מופרש ותוכן מעיים אחרים. ניתן לכמת את מידת שלשול באמצעות מדידות פשוטות מספר13. (פ’) cholerae זה יש כבר מופרש על ידי דגים נגועים יכול להמשיך להדביק לדגים נאיביים, להשלמת המעגל זיהומיות. לפיכך, המודל דג זברה recapitulates נ’ cholerae מחלות אנושיות תהליך12,14.

בשימוש לעתים קרובות ביותר נ’ cholerae חייתיים היו עכברים וארנבות,14,15,16,17,18. מודלים אלה סייעו בהוספת לידע שלנו של נ’ cholerae פתוגנזה. עם זאת, כי עכברים וארנבות, אינם טבעיים נ’ cholerae מארחים, קיימות מגבלות אילו היבטים של מחזור חיי נ’ cholerae יכול להילמד. הקולוניזציה נ’ cholerae של עכברים וארנבות, דורש בדרך כלל העדר של microbiota מעיים או רעלני באנטיביוטיקה כדי לפגוע microbiota של המעי. שני הדגמים דורשים gavage להציג לחיידקים מערכת העיכול או מניפולציה כירורגי ישירות להחדיר את החיידקים לתוך המעיים. דג זברה יש יתרון בכך דג בוגר עם microbiota מעיים ללא פגע הם התנחלו בקלות תהליך זיהומיות קורה באופן טבעי, ללא כל פעולה הדרושה.

העבודה הנוכחית ממחישה את הניצול של דג זברה כמודל באיזמיר נ’ cholerae זיהום. הזיהום, דיסקציה, ספירה של להמדינות נ’ cholerae, כימות של שלשול הנגרם על ידי נ’ cholerae יהיה לתאר12,13. מודל זה סביר להניח שתהיה שימושית למדענים מעוניין תהליך המחלה נ’ cholerae והן בסגנון נ’ cholerae סביבתיים.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של ווין סטייט. שיטה זו תוארה לראשונה בשנת Runft. et al. 12 1. קביעת רמות קולוניזציה מעיים הערה: קולוניזציה מעיים הוא מדד שימושי ביותר במודל דג זברה כמו זה יכול לשמש כדי ל…

Representative Results

(פ’) cholerae התיישבות ספינלי מעיים דג זברה כדי לספק דוגמה של רמות קולוניזציה אופייני שלנו להתבונן, אנחנו מחוסן 5 x 106 CFU של מגיפת באל תור נ’ cholerae המתח N16961 ב 200 מ של מים בתוך המכיל מספר דג זברה. לאחר 6 שעות של זיהום, הדגים היו נשטפים במי?…

Discussion

דג זברה היא מודל חדש יחסית ללמוד נ’ cholerae אך טומן בחובו הרבה הבטחה הגילוי העתידי של היבטים לא מוכרת של נ’ cholerae ביולוגיה ו פתוגנזה11,12,13 . המודל דג זברה למבוגרים יש את היתרונות של להיות טבעי שני מארח נ’ cholerae המכיל microbiota מעיים ללא פ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

תודה נילי מלודי, ג’ון אלן, באזל Abuaita, ו דונה Runft על מאמציהם בסיוע לפיתוח המודל דג זברה. המחקר דיווחו כאן נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספרי פרס R21AI095520 ו- R01AI127390 (כדי ג’פרי ה Withey). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

Materials

Instrument
Shaker incubator New Brunswick Scientific, Edison, NJ Excella E25
Incubator NUAIRE, Plymouth, MN Auto Flow
Spectrophotometer Thermo, Waltham, MA Geaesys 6
Vortex homogenizer Minibeadbeater24 112011
Weighing Machine Ohaus, Columbia, MD Adventurer Pro
Heat Stirer Corning, Corning, NY PC-420D
Burner
automated colony counter REVSCI 120417B
Materials
400 ml glass beakers Pyrex
perforated lids Microtip holder with holes from tip box
disposable plastic spoons Office Depot, Boca Raton, FL D15-25-7008
Fish Tank System Aquaneering, San Diego, CA
RO Water Purifier Aqua FX TK001
Fish net Marina
fish food Tetra fin
Brine Shrimp Red jungle brand O.S.I. pro 80
Styrofoam board
Pins
Scalpels Fine Scientific tools, Foster City, CA 10000-10
Forceps Fine Scientific tools, Foster City, CA 11223-20
Vannas scissors Fine Scientific tools, Foster City, CA 15000-11
2 ml screw cap tubes Fisher Scientific, Hampton, NH 02-681-375
1 mm glass beads Bio Spec 11079110
Glass beads for spreading Sigma, St. Louis, MO 18406-500G
Petri plate Fisher Brand, Hampton, NH FB0875713
1.5 ml centrifuge tube Midsci, Valley Park, MO AVSS1700
50 ml centrifuge tube Corning Falcon, Corning, NY 352098
Test tubes Pyrex 9820
Glass Pipette Fisher Brand, Hampton, NH 13675K
Micro pipettes Sartorius Biohit, Göttingen, Germany m1000/m200/m20
Tips Genesee Scientific, San Diego, CA 24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered saline VWR Life Science, Radnor, PA K813-500ml
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma, St. Louis, MO A5040
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Sigma, St. Louis, MO 10651745001
Schiff’s reagent Sigma, St. Louis, MO 84655-250 mL
periodic acid Fisher Scientific, Hampton, NH 10450-60-9
Mucin from porcine stomach Sigma, St. Louis, MO M2378-100G
Bovine serum albumin Fisher Scientific, Hampton, NH 9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay Reagent Thermo, Waltham, MA 22660
LB medium
Trypton BD Biosciences, San Jose, CA 211705
Teast Extract BD Biosciences, San Jose, CA 212750
NACL Fisher Scientific, Hampton, NH BP358-212
Agar BD Biosciences, San Jose, CA 214010
TCBS Agar BD Biosciences, San Jose, CA 265020
DCLS Agar Sigma, St. Louis, MO 70135-500gm
Software
Microsoft office
Prism 5

References

  1. Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).
  2. Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).
  3. Huq, A., et al. Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods. Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).
  4. Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population. Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).
  5. Broza, M., Halpern, M. Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae. Nature. 412 (6842), 40 (2001).
  6. Halpern, M., Izhaki, I. Fish as hosts of Vibrio cholerae. Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).
  7. Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae. PLoS ONE. 5 (1), e8607 (2010).
  8. Traore, O., et al. Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso. The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).
  9. Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank. Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).
  10. Torres-Vitela, M. A., et al. Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico. Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).
  11. Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).
  12. Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
  13. Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
  14. Klose, K. E. The suckling mouse model of cholera. Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).
  15. Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn, H., Sprinz, Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine. British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).
  16. Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment. The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).
  17. Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea. Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).
  18. Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits. mBio. 1 (1), (2010).
  19. Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. Periodic acid-Schiff’s reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format. Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).
  20. Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India. Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).
  21. Hasan, N. A., et al. Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).

Play Video

Cite This Article
Nag, D., Mitchell, K., Breen, P., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model. J. Vis. Exp. (137), e57767, doi:10.3791/57767 (2018).

View Video