미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

Summary

여기, 우리는 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 정확한 정량화를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 프로토콜에서 우리 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 mtDNA의 이차 구조에 의해 발생 하는 mtDNA 메 틸 화 수준의 과대평가 방지 하는 데 사용할 수 있습니다와 결합으로 DNA의 효소 소화를 설명 합니다.

Abstract

DNA 메 틸 화의 정량화는 황산 시퀀싱, 단일 가닥 DNA 컨텍스트에서 uracil unmethylated 시 토 신을 변환할 나트륨 황산의 재산의 활용을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 중 아 황산 염 연속 수 대상 (PCR를 사용 하 여) 또는 전체 게놈에서 수행 하며 단일 기본 해상도에서 시 토 신 메 틸 화의 절대 정량화. 특히 이차 구조에에서 핵과 미토 콘 드리 아 DNA의 독특한 성격을 감안할 때, 조사에서 mtDNA 시 토 신 메 틸 화 황산 시퀀싱 방법의 적응 해야 한다. MtDNA의 2 차 및 3 차 구조 황산 황산 단일 가닥 dna의 불완전 한 변성 가난한 액세스 인해 가양성을 선도 하는 아티팩트를 시퀀싱 실제로 발생할 수 있습니다. 여기, 우리 사용 하 여 DNA의 효소 소화 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 함께 정확한 정량화의 시 토 신 메 틸 화 수준의 mtDNA에 있도록 하는 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 우리는 mtDNA에 황산 시퀀싱 뇌관을 디자인 하기 위한 지침을 제공, 바람직하지 않은 핵 미토 콘 드 리아 세그먼트를 대상으로 하는 피하기 위하여 (NUMTs) 핵 게놈으로 삽입.

Introduction

미토 콘 드리 아 게놈은 약 16.5 킬로 베이스 (kb)의 원형, 더블-좌초 구조, 무거운 및 빛 가닥의 구성. 미토 콘 드리 아 게놈 임산부-상속, 각 셀 내에서 여러 복사본에 존재 이며 호흡 사슬의 단지¹의 필수 구성 요소를 인코딩합니다. 마찬가지로 세균성 게놈을 핵 게놈 달리 미토 콘 드리 아 게놈은 구성 수많은 2 차 및 3 차 구조에와 같은 코일 및 supercoiled 구조²는 렌더링할 수 액세스 어려운 시퀀싱 중에 실험³.

핵에서 DNA의 메 틸 화는 유전자 발현의 규칙에 특히 수많은 프로세스에서 역할을 광범위 하 게 공부 epigenetic 표시입니다. 포유류 게놈에서 DNA 메 틸 화는 CG 디 (CpG)에 주로 deoxycytidines의 pyrimidine 링의 5 위치에 주로 발생합니다. 시 토 신 메 틸 화 DNA 기초⁴체세포와 총의 ~ 1 %의 게놈에서 모든 소비재의 70%에서 발견 된다. DNA methylations CpA, CpT, CpC 등 소비재가 아닌 상황에도 설명 되어 및 배아 줄기 세포⁵

Protocol

1. 제한 효소 처리

1. 총 인간 DNA 제한 효소 BamHI 위치 14258 인간의 미토 콘 드리 아 DNA에 상처를 치료 하 여 mtDNA를 선형화.
   참고: 마우스 DNA 위해 아래와 같이 동일한 조건에서 제한 효소 BglII를 사용 합니다.
2. 각 샘플 mtDNA 메 틸 화 평가 한 0.2 mL 반응 관을 준비 하 고 (fluorometry에 의해 계량), 다음 믹스: 3 μ g 게놈 DNA를 추가 하는 15 μ 버퍼 3, 3 μ BamHI와 150 μ의 최대 물
3. 4 h 37 ° c.에 대 한 열 cycler에 있는 장소 관

2. 황산 변환

1. BamHI 치료 DNA 나트륨 황산²⁹설명 되어 있는 대로 사용 하 여 변환 합니다.
2. 200-500 ng BamHI 치료 DNA를 사용 하 여 각 변환 반응 20 μ의 전체 볼륨에 대 한. DNA 복구 50-70%입니다.
3. 황산 변환 DNA 10 μ 차입 버퍼에 elute
4. Fluorometry에 의해 단일 가닥 DNA를 계량.
5. 선택 사항: 프로토콜의 나머지를 진행 하기 전에-20 ° C에서의 황산 변환 DNA를....

Results

이 프로토콜에 두 단계는 mtDNA 메 틸 화를 조사할 때 중요 합니다. 1) 이차 구조 및 미토 콘 드리 아 DNA 특정 뇌관의 2) 디자인의 오프닝.

제한 효소 BamHI (그림 1) 인간의 게놈 DNA를 소화 하 여 미토 콘 드리 아 DNA 구조는 뉴클레오티드 위치 14,258에 삭감 될 것 이다 그리고 이차 구조를 열 것 이다.

그대로 mtDNA 이차 구조와 황산의 가능한 장애 mtDNA unconversion 속도과 대 평가 매우 높습니다. 중 아 황산 염 연속, mtDNA unconversion 속도 조사에 소화, 미토 콘 드리 아 게놈의 5 가지 영역에서 인간 골격 근육 세포에서 전체 DNA.......

Discussion

여기, 우리는 mtDNA 메 틸 화를 심문 하도록 특별히 설계 된 황산 시퀀싱 프로토콜을 제공 합니다. Genomic DNA에 사용 되는 황산-시퀀싱 프로토콜 차이 NUMT 시퀀스에서 거짓 긍정적인 발생 밖으로 지배 이전 금지 효소 소화 단계 및 bioinformatic 분석의 활용에 있다.

우리는 mtDNA 메 틸 화를 조사할 때 황산 시퀀싱 아티팩트를 피하기 위해 프로토콜을 제공 합니다. 가양성을 선도 하는 황산 시퀀싱 유물 이전 보고³⁷했다. K 되었습니다 가수분해에 의해 DNA 액세서리 단백질의 부족 제거³⁷을 설명 합니다. 불완전 한 변성 또는 부분 reannealing 이어질 수 있습니다 불완전 한 변환의 뻗어 아마도 단일 가닥 DNA³⁷황산의 액세스를 낮춰서. 나중 유물 mtDNA에 놀이에 이차 구조 cytosines에 대 한 액세스를 손상.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BamHI	New England BioLabs	# R0136
EZ DNA 메틸화-번개 키트	Zymo Research	# D5030
Qubit ssDNA 어세이	Thermo Fisher Scientific	# Q10212
큐비트 어세이 튜브	Thermo Fisher Scientific	# Q32856
HotStarTaq plus DNA 중합효소 키트	Qiagen	# 203603
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	# 28704
NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina	New England BioLabs	# E7370S
NEBNext Multiplex Oligo for Illumina	New England BioLabs	# E7335S
AMPure XP Beads	Beckman Coulter	# A63881
고감도 DNA 칩	Agilent	# 5067-4626
큐비트 고감도 dsDNA 분석	Thermo Fisher Scientific	# Q33230
MiSeq 시약 키트 v2 300 사이클	Illumina	# MS-102-2003
PhiX control v3	Illumina	# FC-110-3001
수산화나트륨	Sigma	# S5881
열 순환기 C1000	Biorad	# 1851148
CFX96 Real-Time PCR 감지 시스템	Biorad	#1855195
Qubit 형광측정기	Thermo Fisher Scientific	# Q33226
Bioanalyzer 2100	Agilent	# G2939BA
MiSeq 기기	Illumina	# SY-410-1003