用抗体阵列对信号转导通路的审问对酪氨酸激酶抑制剂的抗性评价
Summary
在这里, 我们提出了抗体阵列的协议, 以确定各种细胞模型中信号通路的变化。这些变化, 由药物/缺氧/紫外线光/辐射, 或过度表达/下调/挖空, 是重要的各种疾病模型, 并可以表明治疗是否有效或能识别药物的机制电阻。
Abstract
癌症患者对蛋白质磷酸化网络的异常调节通常是用酪氨酸激酶抑制剂治疗的。反应率接近85% 是常见的。不幸的是, 患者往往通过改变信号转导通路而成为治疗的顽固。使用微阵列的表达式分析的实现可以识别整个 mRNA 水平的变化, 蛋白质组学可以识别蛋白质水平的总体变化, 或者可以识别所涉及的蛋白质, 但信号传导的活动途径只能通过询问翻译后的蛋白质的修改来建立。因此, 确定药物治疗是否成功或是否出现抗药性的能力, 或者是否能够表征信号通路的任何改变, 是一项重要的临床挑战。在这里, 我们提供了一个详细的解释抗体阵列作为一个工具, 可以识别全系统的变化, 在不同的翻译后修改 (例如, 磷酸化)。使用抗体阵列的优点之一包括它们的可访问性 (阵列不需要蛋白质组学或昂贵设备的专家) 和速度。针对组合后翻译修改的阵列的可用性是主要的限制。此外, 无偏方法 (phosphoproteomics) 可能更适合于新发现, 而抗体阵列是最广泛的特征目标的理想。
Introduction
靶向酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 的临床应用, 为医生提供了有效的工具来靶向推动肿瘤转化的特定蛋白, 从而改变了癌症治疗的效果。这些化合物抑制或阻止酪氨酸激酶1,2靶蛋白的磷酸化。TKIs 的发展部分是因为各种关键信号基因的基因改变足以推动癌症的启动和进展 [如表皮生长因子受体 (EGFR), 原癌基因酪氨酸-蛋白激酶 src (src),BCR, 人表皮生长因子受体 2 (HER2)]3,4。TKIs 对细胞周期5和分子信号通路6的影响代表了从不相关到分子导向肿瘤治疗的转变。TKIs与化疗的主要优点是反应速度增加, 对健康细胞的毒性风险降低7。因此, 对新型 TKIs 的研究与开发越来越受到重视。
对基因组测序结果的访问开始于人类基因组项目8、9、10 , 并在今天继续进行各种下一代 (NextGen) 癌症测序工作 [例如, 癌症基因组阿特拉斯 (TCGA)11,12]。这启发了许多实验方法, 提供成千上万基因的同时信息和/或提供无偏见的快照的基因或蛋白质调制的生物扰动13。由于细胞功能的调节发生在多个层次, 从基因的转录到蛋白质的后转化修饰和它们的活动, 对控制细胞功能的事件的完全理解将最终需要从各种生物读数中集成数据。通过单细胞基因分辨率来监测成千上万基因的信使 RNA (mRNA) 水平, 提高了对基因功能和整个基因组的相互作用进行推断的能力。然而, 基因表达阵列的解释将永远是完全不完整的, 没有整合其他水平的调节: 即蛋白质表达水平, 蛋白质修饰状态, 和蛋白质后转化修改 (磷酸化、泛素化、甲基化等)。在这里, 我们描述的效用, 抗体阵列作为手段, 以审问后修改的重要信号元件作为一个功能的各种条件在一个实验14,15,16。
磷抗体阵列可以用来区分和分析信号传导通路16的变化。这些可能来自基因修饰或细胞系的治疗与激酶抑制剂, 化疗, 压力引起的葡萄糖剥夺, 缺氧, 或血清饥饿。注意, 耐药性或特定基因的下调也可能导致信号转导通路17的变化。
例如, 药物耐药性可以从药物靶的突变中产生, 以避免敏感。在肺癌中, 已知的 EGFR 突变使癌症不受影响到某些 TKIs, 但更容易受到其他人的影响。替代信号通路可以激活后, 突变17。作为一个更广泛的应用, 以识别的信号转导通路参与抵抗和缺氧等, 磷抗体阵列提供更多的洞察, 并因此了解, 所涉及的机制。
允许对蛋白质修饰进行评估的技术是系统生物学的一个重要组成部分, 因为它们通常服务于调节功能, 例如调节酶的活性或蛋白质之间的物理相互作用。在几乎所有细胞外触发信号传导通路18中, 蛋白质磷酸化的作用说明了转化后修饰的重要性。传统上, 蛋白激酶的鉴定或蛋白质的磷酸化状态也可以由西方的印迹分析来确定, 特别是如果研究者只对1–5目标感兴趣。然而, 西方的印迹是非常有选择性的, 可以偏向先验知识, 可能会错过重要的目标, 结果。抗体阵列通过嵌入各种捕获抗体 [泛特异磷酸化酪氨酸 (s)、反泛素等] 在固体基质 (如玻璃或硝化纤维素) 中, 提供了多目标的中等吞吐量读数。次级抗体提供了基于三明治的 ELISA 格式的特定蛋白质的信息 (图 1)。随着更多的目标感兴趣或先前的知识被限制在15, 这种分析变得更加强大和相关。磷阵列是更广泛的可就业, 因为他们可以比较的磷酸化和一般数量的蛋白质的更广泛的目标在一个实验, 并提供了显着改善量化的质谱。这种技术不适用于鉴定新的或以前未知的磷酸化地点。
基于大规模质谱的蛋白质组学可以用来识别特定的磷酸化部位的蛋白质19。虽然这项技术可以列举数以千计的翻译后事件, 它需要昂贵的仪器, 专用的实验管道, 和计算专长, 是超出了大多数研究人员。
抗体阵列提供了在不同的蛋白质读数16的同时读数。这些可能是蛋白质泛素化 (泛素阵列) 或磷酸化的变化。该阵列技术的主要优点是, 它提供了重要的反馈, 对与重要细胞参数相关的各种生物通路 (蛋白质 53 kDa, p53, 受体酪氨酸激酶, 细胞内通路) 的生物状态。同时。此外, 可以结合各种阵列类型, 以增加检测的渗透 (例如, 凋亡和泛素和磷酸化)。这种将多个阵列组合在一起以时间和成本效益的方式来评估多个样本中的各种平移后更改的能力, 在这种情况下是一个很大的优势。抗体阵列。
Protocol
Representative Results
Discussion
将许多生物读数结合在一起进行的实验中, 是细胞机械的更准确的表示方法。磷抗体阵列的出现使对修饰模式的快速表征, 这可能比任何单一蛋白质的修饰状态更具信息量。应用磷抗体阵列的一般工作流程是基于对丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的修饰。这个例子集中于描述与肺癌治疗的抗性相关的变化。这个应用的主要依据是蛋白质磷酸化在许多人的癌症18的信号转导中起着中心作用,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢劳伦斯·埃里森变革医学研究所的慷慨财政支持 (大卫 Agus 的礼物)。我们感谢秋宝马和丽莎 Flashner 的支持, 这导致了这篇手稿的产生和出版。我们感谢劳拉. 吴的行政支持。
Materials
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
| Tissue Culture dish 100mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27G5/8, 1ml for needle treatment of protein samples |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
References
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