Beurteilung der Widerstandsfähigkeit gegen Tyrosin-Kinase-Inhibitoren durch eine Befragung von Signal Transduction Bahnen durch Antikörper-Arrays
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Antikörper-Arrays zu Veränderungen im Signalwege in verschiedenen zellulären Modellen zu identifizieren. Diese Veränderungen, verursacht durch Medikamente/Hypoxie/ultra-violet Licht/Strahlung oder durch Überexpression/Herabregulation/Knockouts, sind wichtig für die verschiedenen Krankheitsmodelle und können angeben, ob eine Therapie wirksam werden oder Mechanismen der Drogen identifizieren kann Widerstand.
Abstract
Krebspatienten mit einer aberranten Regulierung der Protein-Phosphorylierung-Netzwerke sind oft mit der Tyrosin-Kinase-Inhibitoren behandelt. Annähernd 85 % Response-Raten sind häufig. Leider werden Patienten oft durch eine Änderung ihrer Signalwege Transduktion refraktär gegenüber der Behandlung. Eine Implementierung der Expression profiling mit Microarrays kann insgesamt mRNA-Ebene Änderungen erkennen und Proteomics erkennen die allgemeinen Änderungen im Protein-Ebene oder erkennen die Proteine beteiligt, aber die Aktivität der Signaltransduktion Wege können nur durch Vernehmung Post-translationalen Modifikationen der Proteine hergestellt werden. Infolgedessen ist die Fähigkeit, festzustellen, ob eine medikamentöse Behandlung erfolgreich ist oder ob Widerstand entstand, oder die Fähigkeit, Änderungen in der Signalwege charakterisieren eine wichtige klinische Herausforderung. Hier bieten wir eine ausführliche Erläuterung der Antikörper-Arrays als ein Werkzeug, das systemweite Änderungen in verschiedenen Post-translationalen Modifikationen (z.B. Phosphorylierung) identifizieren kann. Einer der Vorteile der Verwendung von Antikörper-Arrays enthält ihre Zugänglichkeit (ein Array entweder ein Experte für Proteomics oder teure Ausrüstung erfordert keine) und Geschwindigkeit. Die Verfügbarkeit von Arrays, die Ausrichtung auf eine Kombination von Post-translationalen Modifikationen ist die größte Einschränkung. Darüber hinaus möglicherweise unvoreingenommene Ansätze (Phosphoproteomics) besser geeignet für die neuartige Entdeckung, während Antikörper Arrays ideal für die am weitesten verbreitete zeichnet sich Ziele sind.
Introduction
Die klinische Umsetzung von gezielten Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI) hat Krebsbehandlung umgewandelt, indem Ärzte mit wirksame Instrumente, um die spezifische Proteine gezielt diese Fahrt neoplastische Transformation. Diese Verbindungen hemmen oder blockieren die Phosphorylierung von Proteinen gezielt durch Tyrosin-Kinasen1,2. TKIs wurden teilweise entwickelt, weil genetische Veränderungen in verschiedenen wichtigen Gene Signalisierung ausreichen, um Laufwerk Krebs Initiierung und Progression [z. B.epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), protoonkogenproduktes Tyrosin-Protein Kinase Src (SRC), BCR-ABL und menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2)]3,4. Die Auswirkungen der TKIs auf den Zellzyklus-5 und der molekularen Signalisierung Wege6 stellt eine Transformation von der ungezielte Molekular geführte Krebsbehandlung dar. Der entscheidende Vorteil von TKIs versus Chemotherapie ist die erhöhte Response-Raten und die geringere Gefahr der Toxizität auf gesunde Zellen7. Infolgedessen hat es Aufmerksamkeit auf die Erforschung und Entwicklung neuartiger TKIs erhöht.
Zugang zu den Ergebnissen der Genom-Sequenzierung mit dem Human Genome Project8,9,10 begann und bis heute mit verschiedenen nächsten Generation (NextGen) Krebs Sequenzierung Bemühungen [z.B., The Cancer Genome Atlas (TCGA)11,12]. Dies inspirierte viele experimentelle Methoden, die gleichzeitige informieren über Tausende von Genen und/oder geben unvoreingenommene Schnappschüsse von Genen oder Proteinen, die durch biologische Störungen13moduliert. Da die Verordnung der zellulären Funktion auf mehreren Ebenen aus der Transkription von Genen, die Post-translationale Modifikation von Proteinen und deren Aktivität auftritt wird ein vollständiges Verständnis der Ereignisse steuern die zelluläre Funktion Schließlich erfordern Sie eine Integration von Daten aus verschiedenen biologischen auslesen. Die Fähigkeit, die Boten-RNA (mRNA) Pegel Tausender Gene mit einer einzelligen gen Auflösung überwachen, hat die Möglichkeit, Rückschlüsse auf die Genfunktion und Interaktionen im Maßstab des gesamten Genoms machen erhöht. Die Interpretation der Gen-Expression-Arrays werden jedoch immer von Natur aus unvollständig ohne die Integration von anderen Ebenen der Verordnung: nämlich die proteingehalte Ausdruck, die Protein Modifikation Staaten und das Post-translationale Protein Änderungen (Phosphorylierung, Ubiquitylation, Methylierung, etc.). Hier beschreiben wir die Nützlichkeit des Antikörper-Arrays als Mittel zur Post-translationalen Modifikationen wichtiger Signalisierung Komponenten in Abhängigkeit von verschiedenen Bedingungen in einem einzigen Experiment14,15, zu befragen 16.
Phospho-Antikörper-Arrays können eingesetzt werden, zu unterscheiden und zu Änderungen in den Signal Transduction Bahnen16zu analysieren. Diese können durch eine genetische Veränderung oder Behandlungen von Zelllinien mit Kinase-Inhibitoren, Chemotherapeutika, Belastungen durch Glukose Entbehrung, Hypoxie oder Serum Hunger entstehen. Note, Resistenzen oder ein bestimmtes Gen kann up- oder Herabregulation auch Änderungen im Signal Transduction Bahnen17führen.
Resistenzen, entstehen beispielsweise durch Mutationen des Drug Targets Empfindlichkeit zu vermeiden. Bei Lungenkrebs, bekannt EGFR-Mutationen Rendern den Krebs zu bestimmten TKIs stoßunempfindlich, aber anfälliger für andere. Bei der Mutation17kann Alternative Signalwege aktiviert werden. Als eine breitere Anwendung zur Identifizierung der Transduktion Signalwege Widerstand und Hypoxie usw.beteiligt Phospho-Antikörper Arrays bieten einen besseren Einblick in und folglich zu verstehen, die Mechanismen beteiligt.
Technologien, die Bewertung der Protein Änderungen darstellen einen wichtigen Bestandteil der Systembiologie, weil sie oft eine regulatorische Funktion, z. B. Modulation der Aktivität eines Enzyms oder die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Proteinen dienen. Die Bedeutung der Post-translationalen Modifikationen wird durch die Rolle des Protein-Phosphorylierung in fast alle extrazellulären ausgelöste Signal Transduction Bahnen18dargestellt. Traditionell, konnte die Identifizierung der Kinasen oder über den Status der Phosphorylierung von Proteinen auch von Western-Blot Analyse ermittelt werden, vor allem, wenn die Forscher nur 1 – 5 Ziele interessiert ist. Aber Western Blots sind sehr wählerisch und Vorkenntnisse voreingenommen sein können und möglicherweise verpassen wichtige Ziele als Ergebnis. Antikörper-Arrays bieten eine Medium-Durchsatz Auslesen der mehrere Ziele durch das Einbetten von verschiedenen Aufnahme-Antikörper [Pan-spezifische phosphorylierten Tyrosine(s), Anti-Ubiquitin usw.]auf einer festen Matrix (z.B., Glas oder Nitrozellulose). Sekundärantikörper geben Auskunft über bestimmte Proteine in einem Sandwich-basierte ELISA-Format (Abbildung 1). Dieser Assay wird leistungsfähiger und relevant wie mehr Ziele von Interesse sind oder der Vorkenntnissen nur15 ist. Die Phospho-Arrays sind breiter einsetzbar, da sie können Phosphorylierung sowie allgemeine Mengen des Proteins eine breitere Palette von Zielen in einem Experiment zu vergleichen und eine deutlich bessere Quantifizierung über Massenspektrometrie bieten. Dieses Verfahren gilt nicht für die Identifizierung von neuen oder bisher unbekannten Phosphorylierung Websites.
Große Massen Spektrometrie-basierte Proteomics könnte eingesetzt werden, um spezifische Phosphorylierung Standorte von Proteinen19. Obwohl diese Technik Tausende von Post-translationalen Veranstaltungen auflisten kann, erfordert es teuer Instrumentierung, engagierten experimentellen Pipelines und eine rechnerische Expertise, die außerhalb der Reichweite der meisten Forscher sind.
Antikörper-Arrays bieten eine gleichzeitige Anzeige auf verschiedenen Protein Auslesen16. Diese dürfen Änderungen im Protein Ubiquitylation (Ubiquitin Array) oder Phosphorylierung. Der entscheidende Vorteil dieser Array-Technologie ist, dass es wichtige Rückmeldungen auf den biologischen Zustand verschiedener biologischer Signalwege zugeordnet wichtige zellenparameter (Protein p53, 53 kDa, Rezeptor-Tyrosin-Kinasen und intrazellulären Signalwege) bietet gleichzeitig. Darüber hinaus ist es möglich, verschiedene Arraytypen um das Eindringen von einem Assay (z.B., Apoptose und Ubiquitin und Phosphorylierung) erhöhen zu kombinieren. Diese Fähigkeit, mehrere Arrays um verschiedene Post-translationalen Änderungen in mehreren Proben gleichzeitig in einer Zeit und Kosten wirtschaftlicheren Weise zu bewerten, die nicht spezielle Instrumente oder Know-how erfordert zu kombinieren ist ein wesentlicher Vorteil im Fall der Antikörper-Arrays.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ansätze, die viele biologische anzeigen zu kombinieren sind von Natur aus eine genauere Darstellungen der zellulären Maschinerie in einem Experiment durchgeführt. Das Aufkommen des Phospho-Antikörper Arrays ermöglicht eine schnelle Charakterisierung des Musters der Änderungen, die informativer als der Änderungsstand jeder einzigen Proteins werden kann. Die allgemeine Workflow für die Anwendung des Phospho-Antikörper Arrays basiert auf einer Änderung in Serin, Threonin oder Tyrosin. Dieses Beispiel konzentriert …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für die großzügige finanzielle Unterstützung von Lawrence J. Ellison Institut für Transformative Medizin der USC (ein Geschenk an David Agus). Wir freuen uns über die Unterstützung der Herbst Beemer und Lisa Flashner führt zu der Generation und Veröffentlichung dieses Manuskriptes. Wir danken Laura Ng für ihre administrative Unterstützung.
Materials
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
| Tissue Culture dish 100mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27G5/8, 1ml for needle treatment of protein samples |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
References
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