깨어 있는 쥐에 유리 Optrode 신경 형식의 Optogenetics 식별

요약

이 작품은 optogenetic 단일-단위 맞춤 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 안정적으로 녹화를 수행 하는 방법을 소개 합니다.

초록

그것은 어떻게 다른 신경 과학에서 중요 한 관심사 종류 뉴런의 신경 회로에서 작동. Optogenetics의 최근 발전은 광범위 한 뇌 영역에 vivo에서 electrophysiological 실험에서 신경 유형 식별을 활성화 했습니다. Optogenetics 실험, 그것이 기록 사이트에 빛을 전달 하기 위해 중요 합니다. 그러나, 그것은 종종 뇌의 표면에서 깊은 두뇌 영역을 자극 빛을 제공 어렵다입니다. 특히, 그것은 종종 깨어 있는 동물에서 녹음의 경우 뇌 표면의 광 투명성은 낮은, 깊은 두뇌 지역 도달 자극 빛 어렵습니다. 여기, 우리는 주문 품 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 빛을 스파이크 응답 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법에서는, 빛은 안정적으로 깊은 두뇌 지구에서 빛으로 기록 된 신경 자극 수 있도록 녹음 유리 전극을 통해 배달 됩니다. 이 주문 품 optrode 시스템 접근 가능 하 고 저렴 한 재료를 이루어져 있고 조립 하기 쉽습니다.

서론

다양 한 종류의 다른 기능을 하는 신경 중추에 의하여 이루어져 있다. 이러한 서로 다른 유형의 신경 신경 회로 내에서 작동 하는 어떻게 신경 과학에서 중요 한 관심사 중 하나입니다. 그러나, 많은 두뇌 지구에서 그것은 되었습니다 하지 몇 가지 예외와 함께 전기 스파이크 신호 자체에 분명 차이가 있기 때문에 전기 활동의 비보에 녹음에 신경 종류를 구별 하는 것. Optogenetics의 최근 발전 돌파구^1,2를 만들었습니다. 빛에 민감한 opsin (예를 들어, channelrhodopsin-2) 특정 신경 종류에 표현 하는 유전자 변형 동물을 사용 하 여, 그것은 되었다 vivo에서 녹음^3, 에서 효율적으로 신경 종류를 구별할 수 ^4,,56. 이 동물에 빛에 민감한 opsin와 뉴런 전기 녹음 하는 동안 가벼운 자극을 제공 하 여 흥분 하지만 다른 신경 있습니다. Opsin 양성 신경, 따라서 쉽게 구별 된다 다른....

프로토콜

모든 절차는 동물 관리 위원회의 가나자와 의과대학의 승인와 일본의 생리 사회의 원칙에 따라 수행 됩니다.

1입니다. 건설 유리 Optrode 홀더

참고: 유리 optrode 홀더를 구축 하는 상업 전극 홀더 사용 됩니다 (그림 1A).

1. 부드럽게 소유자의 배럴에서 압력 제어를 위해 스틸 튜브 밖으로 당겨.
2. 드릴링에 의해 소유자의 배럴에서 핀 좌석 쪽의 구멍을 확대. 깊이 3 m m 직경에서 그리고 12mm 구멍을 확인 합니다.
3. 스테인리스 강 관 (직경에서 3 m m, 두께, 0.5 m m 그리고 길이; 8 m m를 넣어 그림 1A 2) 구멍에.
4. 구멍에 ⌀2.5 m m 깃 봉 (그림 1A1)에 대 한 짝짓기 소매를 분할 하는 세라믹을 삽입 합니다.
5. 에폭시 접착제는 L 자 모양의 사 개에 전극 홀더의 배럴을 수정 합니다.
6. 사 개에 구멍 (직경에서 3 m m)를 확인 하 고 나....

결과

그림 2, 우리는 팁 크기의 효과 유리 펫 펫 (그림 2A-B)의 끝에 빛 파워에의 길이 검사합니다. 가벼운 힘 1 m m 팁에서 배치 하는 광 파워 미터에 의해 측정 되었다. 팁 크기 전체 길이 변화 때 2.5 µ m 팁 크기 설정 하는 동안, 변화 하는 때 전체 길이 50 ± 2 mm로 설정 되었습니다. 유리 피 펫의 샹 크 8 m m로 설정 되었습니다. 3-5 mW (평균 ± SD;에서 배열 하는 끝에 가벼운 힘 그림 2A: 3.77 ± 0.29 mW, n = 20; 그림 2B: 4.24 ± 0.31 mW, n = 21). 펫의 팁 크기 (그림 2A

토론

Optogenetics 신경 과학에 강력한 도구가 되고있다. 그것은 특정 신경 통로의 활동을 조작 뿐만 아니라 특정 신경 형식에서을 식별 비보에 이용 되었습니다. 신경 종류의 신경 활동의 명확한 신경 회로의 메커니즘의 이해를 촉진합니다. 여기, 우리는 깨어 VGAT ChR2 쥐의 IC에 유리 전극을 통해 녹음 사이트에 빛을 전달 하는 방법을 설명 했다.

설명 하는 방법을 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 그것은 동물 대상 신경에 있는 opsins의 충분 한 및 특정 식을 사용 하 여 요구입니다. Extracellular 녹음과 빛에 대 한 응답을 식별 하는 opsin 활성화 대상 신경에서 스파이크 끝이 필요 하다. 일부 유전자 변형 종자에 신경에 있는 transgene 식 수준 낮은 젊은 동물¹⁴, 그리고 실험에 대 한 최소 연령은 있을 가능 하다. 또한, 그것은 빛 자극에 응답 (예를 들어, imm.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
전극 홀더	분자 장치	1-HL-U	마이크로 전극 증폭기 용 피펫 홀더
세라믹 분할 결합 슬리브	Thorlabs	ADAF1	f2.5 mm 페룰
회로 기판 스페이서	Teishin Denki	SPA-320	f8.0 mm, 20.0 mm 길이
마우스 용 입체 프레임	Narishige	SR-6M-HT	마우스
용 입체 운동 기기매니퓰레이터	Narishige	NA	수동 매니퓰레이터
Superbond	Sun Medical	M: 204610557	치과용 접착제 수지 시멘트
Form2	Formlabs	NA	3D 프린터
Kwik-Sil	WPI	KWIK-SIL	저독성 실리콘 접착제
붕규산 유리 모세관	Narishige	GD-1.5	OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 길이 90.0 mm
광섬유 패치 코드	Doric 렌즈	MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5	단섬유 패치코드, OD, 2.5mm, 코어 = 960mm, 클래딩 = 1000mm, NA = 0.63
연결 LED	Doric 렌즈	LEDC-1B_FC	중심파 길이 = 465nm, 출력 전력 = 45mW(코어 960mm 0.63NA)
LED 드라이버	Doric 렌즈	LEDRV_1CH_1000	1채널 LED 드라이버, 최대 출력 = 1000mA
전극 풀러	Narishige	PB-7	2단 유리 마이크로피펫 풀러
붕규산 유리 모세관	Narishige	GD-1.5	볼로실리케이트 유리 모세관, OD, 1.5mm, ID, 0.9mm, 90.0mm 길이
GENTACIN	MSD CO., LTD	185711173	항생제 연고
Terramycin®-LA	Zoetis	G 333	Oxytetracycline
Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J	Jackson Labs	#14548	VGAT-ChR2 마우스
멀티클램프 700B	분자 장치	2500-0157	미세 전극 증폭기