L'analisi di espressione genica tramite rilevazione di attività di β-galattosidasi in embrioni di topo intero
Summary
Qui descriviamo il protocollo standard per la rilevazione di attività di β-galattosidasi in primi embrioni di topo intero e il metodo per paraffina sezionamento e colorazione di contrasto. Si tratta di una procedura facile e veloce per monitorare l’espressione genica durante lo sviluppo che può essere applicato anche a sezioni di tessuto, organi o cellule coltivate.
Abstract
L’Escherichia coli LacZ gene che codifica per β-galattosidasi, è in gran parte utilizzato come reporter per l’espressione genica e come tracciante negli studi di lignaggio cellulare. La classica reazione istochimica si basa sull’idrolisi del substrato X-gal in combinazione con gli ioni ferrici e ferrosi, che produce un precipitato insolubile blu che è facile da visualizzare. Di conseguenza, attività della β-galattosidasi serve come indicatore per il modello di espressione del gene di interesse lo sviluppo procede. Qui descriviamo il protocollo standard per la rilevazione di attività di β-galattosidasi in primi embrioni di topo intero e il conseguente metodo per paraffina sezionamento e colorazione di contrasto. Inoltre, è disponibile una procedura per chiarire interi embrioni per visualizzare meglio il X-gal macchiatura in regioni più profonde dell’embrione. Risultati costanti ottenuti eseguendo questa procedura, anche se l’ottimizzazione delle condizioni di reazione è necessaria per ridurre l’attività di sfondo. Limitazioni nel dosaggio dovrebbero essere considerati anche, specialmente per quanto riguarda le dimensioni dell’embrione intero supporto della colorazione. Il nostro protocollo prevede un sensibile e un metodo affidabile per la rilevazione di β-galattosidasi durante lo sviluppo del mouse che possa essere applicato alle sezioni al criostato, nonché di organi interi. Così, la dinamica espressione genica durante lo sviluppo possa essere facilmente analizzati utilizzando questo protocollo in interi embrioni, ma anche espressione dettagliata a livello cellulare può essere valutato dopo il sezionamento della paraffina.
Introduction
Al fine di descrivere il pattern di espressione genica specifici, l’uso di geni reporter come marcatori è stato fondamentale dalla drosofila ai mammiferi. Negli esperimenti che coinvolgono gli animali transgenici e knockoui, il gene batterico β-galattosidasi (LacZ) di Escherichia coli (Escherichia coli) è uno dei più ampiamente usato1,2,3, 4. β-galattosidasi (β-gallone) catalizza l’idrolisi di β-galactosides (come il lattosio) in monosaccaridi (glucosio e galattosio)5. Il substrato più comunemente usato è il X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), un glicoside che viene idrolizzato dalla β-galattosidasi, generando 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole e galattosio. Il primo è ossidato in un dimero che, quando utilizzato combinato con potassio ferri- e ferro-cianuro, produce un caratteristico insolubile, colore blu precipitare (Figura 1)6.
Il gene LacZ iniziò ad essere usato come un gene reporter più di trenta anni fa7,8. Solitamente, LacZ viene inserito a valle di un promotore endogeno nel luogo l’open reading frame, quindi può essere utilizzato nella cultura batterica e cella per visualizzare le celle che contengono un inserto particolare, così come negli animali transgenici come tracciante di endogeno pattern di espressione genica durante lo sviluppo9. A questo proposito, la visualizzazione dell’attività della β-galattosidasi è stato ampiamente utilizzata in drosofila per comprendere i processi cellulari e dello sviluppo da singole cellule ai tessuti tutta. Genetica della drosofila favorisce la generazione di linee stabili in cui un costrutto di P-elemento modificato contenente il gene reporter che lacZ è inserito in modo casuale posizioni nel genoma. Così, quando posto sotto l’influenza degli elementi enhancer può guidare l’espressione in modo specifico del tessuto, che ha permesso l’analisi sistematica dei modelli di espressione di molti geni negli ultimi due decenni10. Inoltre, l’uso di topi transgenici per monitorare l’espressione del gene LacZ consente inoltre di rilevazione degli eventi di ricombinazione genica di Cre-loxP mediata ricombinazione e la localizzazione dei derivati mutante cellule embrionali staminali in analisi chimerici 11, che facilita il controllo di LacZ espressione in tessuti specifici come pure temporaneamente. Inoltre, in interi embrioni, rilevamento dell’attività β-galattosidasi può produrre pattern di colorazione differenziale alle diverse intensità che si possono comodamente osservare attraverso diversi stadi di sviluppo per analizzare i cambiamenti temporali nell’espressione del gene 8,12.
In questo articolo, presentiamo un protocollo per visualizzare l’espressione genica attraverso il X-gal macchiatura nel tessuto intero supporto nelle fasi iniziali dello sviluppo degli embrioni del mouse. Vi presentiamo questo metodo istochimico come una tecnica altamente sensibile e poco costoso che favorisce un rilevamento accurato delle cellule con etichettate intero supporto esemplari o al livello cellulare dopo paraffina embedded tessuti o embrioni. Il metodo consente la visualizzazione diretta di macchiatura nel tessuto del mouse con lo sfondo minimo se confrontato con altri metodi13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il gene LacZ di e. coli è stato ampiamente usato come un reporter in studi di espressione genica a causa della sua alta sensibilità e la facilità di rilevazione. Il presente protocollo descrive un metodo classico per la rilevazione di β-gallone espressione basata su una reazione enzimatica che è facile e veloce da eseguire e poco costoso. Questo metodo può essere applicato anche senza grosse modifiche nell’intero supporto embrioni, organi intatti, sezioni di tessuto criostato o cellule coltivate.
<p cl…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il servizio istopatologico per la loro assistenza tecnica presso il Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Ringraziamo anche Dr. Motoharu Seiki per gentilmente fornendo Mt4-mmpLacZ topi e Dr. Alicia G. Arroyo per sostenere il nostro progetto e per la sua lettura critica del manoscritto. Desideriamo ringraziare Peter Bonney per la correzione di questo articolo. Questo lavoro è stato supportato da Universidad Europea de Madrid tramite una sovvenzione (# 2017UEM01) assegnata al c.s.c.
Materials
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24×60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
References
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
- Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
- Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
- Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
- Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux’s Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
- Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
- Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
- Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
- Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
- Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
- Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
- Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
- Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
- Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
- Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
- Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
- Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
- Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
- Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
- Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
- Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
- Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
- Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
- Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
- Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
- Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
- Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
