Heri, præsenterer vi en protokol, der detaljer de tekniske aspekter og væsentlige krav at sikre robuste IG gen Sekvensanalyse hos patienter med kronisk lymfatisk leukæmi (CLL), baseret på den akkumulerede erfaring af initiativet europæisk forskning på CLL (ERIC).
Under B-celle modning, den komplekse proces af immunglobulin (IG) gen V (D) Jørgensen rekombination kombineret med somatiske hypermutation (SHM) giver anledning til en unik DNA-sekvens inden for hver enkelt B celle. Da B-celle maligniteter resultere fra klonal ekspansion af en enkelt celle, repræsenterer IG gener en unik molekylære signatur fælles til alle maligne celler inden for en bestemt patient; IG gen rearrangementer kan således bruges som klonede markører. Ud over at fungere som et vigtigt klonede id, kan IG gensekvens fungere som en molekylær tidslinje, da det er forbundet med specifikke udviklingsmæssige stadier og dermed afspejler historie af B-celle involveret i den neoplastiske transformation. Derudover for visse maligne sygdomme, især kronisk lymfatisk leukæmi (CLL), IG gensekvens holder prognostiske og potentielt prædiktive kapaciteter. Når det er sagt, ekstrapolere meningsfulde konklusioner fra IG gen Sekvensanalyse ville være umuligt, hvis robuste metoder og værktøjer ikke var til rådighed til at støtte i deres analyse. Denne artikel vil trække på den store erfaring i den europæiske forskningsinitiativ på CLL (ERIC), detaljer de tekniske aspekter og væsentlige krav skal sikre pålidelig og reproducerbar IG gen Sekvensanalyse i CLL, en test, der er nu anbefales for alle CLL patienter før behandling. Mere specifikt, beskrives de forskellige analytiske faser lige fra clonotypic IG gen omlejring identifikation og bestemmelse af nucleotidsekvensen til den præcise kliniske fortolkning af IG-gen ordne i rækkefølge data.
Kronisk lymfatisk leukæmi (CLL), den mest almindelige form for leukæmi hos voksne i de vestlige lande, er karakteriseret ved den klonal ekspansion af modne neoplastiske B celler1. Fra et klinisk perspektiv er sygdomsforløb meget variabel med nogle patienter oplever en aggressiv sygdom, der kræver behandling meget tidligt efter diagnosticering, og ofte recidiverende eller er refraktære over for terapi. Dette er i skarp kontrast til en betydelig procentdel af patienter (~ 30%), der præsenterer med en indolent sygdom, aldrig kræve behandling, og har en levetid svarende til alder-matchede raske personer2. Denne kliniske heterogenitet er afspejlet i mangfoldigheden af de molekylære abnormaliteter fundet i CLL-patienter, som i sidste ende drive patogenese og progression af denne sygdom3.
Etablere en præcis CLL diagnose er som regel ligetil, men den førnævnte kliniske heterogenitet kan hindre den effektive forvaltning af CLL patienter og understreger behovet for prognostiske og prædiktive markører, der kunne hjælpe med at behandling besluttende2. Talrige undersøgelser har forsøgt at forfine prognosticering af CLL, som kulminerede i en overflod af nye kliniske og biologiske markører er foreslåede4. Mutationsmønstre status for clonotypic immunoglobulin tunge variabel (IGHV) genet er en af de mest robuste prognostiske markører i CLL, i vid udstrækning skyldes det, at (i) det forbliver stabile over tid og som sygdommen skrider frem, og (ii) det er uafhængige af andre kliniske og biologiske parametre5. Trods meget få, om nogen markører, herunder IGHV mutationsmønstre status, i øjeblikket anvendes i kliniske rutine på tidspunktet for diagnosen.
Første rapporter om den kliniske anvendelighed af IG-gen sekventering i CLL dato helt tilbage i 1999, da 2 uafhængige undersøgelser rapporteret, at patienter med ingen eller minimal somatiske hypermutation (SHM) belastning (unmutated CLL, U-CLL) har en dårligere prognose end patienter med en højere SHM byrde (muterede CLL, M-CLL)6,7. Mere specifikt, til U-CLL gruppe bestod af tilfælde husly clonotypic IGHV gener med få eller ingen SHM og dermed en høj procent identitet til det nærmeste kønscelleoverførsel IGHV gen (≥98%), mens M-CLL bestod af sager med en højere mutationsmønstre belastning (procent identitet til den nærmeste kønscelleoverførsel IGHV gen < 98%). Siden disse tidlige studier, har det hele tiden vist at U-CLL tilfælde vise en kortere tid til første behandling (TTFT) og samlet overlevelse (OS) i forhold til M-CLL.
Set i bakspejlet fremhævet disse skelsættende undersøgelser den afgørende rolle af B-celle receptoren (BcR) IG i CLL pathobiology, dermed bane vejen for omfattende forskning i CLL-microenvironmental interaktioner, som til gengæld ført til en mere omfattende forståelse af den biologiske heterogenitet af denne sygdom8,9. Nyere undersøgelser har ydet supplerende støtte for betydningen af immunogenetic analyser i CLL ved at afsløre, at enkelte tilfælde kan klynge i delmængder på grund deling (uægte) identiske BcR IG gensekvenser, et fænomen betegnes BcR IG stereotypy10 ,11,12,13. Akkumulere beviser støtter tanken om at patienter, der er tildelt de samme stereotype delmængde harbor lignende clinicobiological egenskaber der tydeligt adskiller dem fra andre CLL patienter inden for kategorien samme SHM men med forskellige IG gensekvenser; Det er faktisk blevet rapporteret, at kategoriseringen af CLL patienter baseret på BcR IG stereotypy yderligere forædler bulk opdeling af CLL patienter i U-CLL eller M-CLL grupper14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20.
Fra et klinisk perspektiv er det bemærkelsesværdigt at SHM status af clonotypic IGHV genet synes at korrelere med et specifikt svar på chemoimmunotherapy. I særlige, M-CLL patienter behandlet med en kombination af cyclophosphamid-fludarabine-rituximab (FK), guld standard behandling for lægeligt synspunkt egnede CLL patienter mangler TP53 genet defekter, udstillet betydeligt længere progressionsfri overlevelse (PFS) og OS i forhold til U-CLL-patienter, som fik samme behandling21,22,23. Derfor, identifikation af SHM status er blevet vigtigt i særdeleshed for at bistå i den terapeutiske ledelse af CLL patienter dvs. en intelligent markør, i stedet for vurderingen af det kliniske forløb af den sygdom dvs. en prognostiske markør. I virkeligheden, ifølge den seneste opdatering af retningslinjerne NCI-sponsoreret af International Workshop om CLL, SHM status for omarrangeret IGHV gener bør være målrettet i alle CLL tilfælde før behandling indledning i både almen praksis og kliniske forsøg24. Desuden, på grund af den nylige godkendelse af roman behandling agenter, og det voksende antal stoffer i forsøg, SHM status af IG molekyle kan spille en endnu større rolle i den terapeutiske ledelse af patienter med CLL i den i nærheden af fremtidige5.
Denne rapport beskriver alle aspekter af IG-gen Sekvensanalyse, begynder med at vælge det passende materiale og kulminerede med den kliniske fortolkning af sekventering resultater. Dybdegående vurdering af disse trin er vigtigt i diagnostisk rutine for produktion af pålidelige resultater og for at sikre nøjagtige tålmodige stratificeringsniveau inden for kliniske forsøg. Protokoller leveres til støtte i harmoniseringen af IG-gen Sekvensanalyse, hvilket sikrer at resultaterne er sammenlignelige blandt forskellige laboratorier.
Studiet af IG gener i CLL har været afgørende for at give en bedre forståelse i sygdom pathobiology men også for at forbedre patientens risiko stratificering. Det er derfor altafgørende, at Multi-trins procedure af IG-gen Sekvensanalyse og efterfølgende fortolkning af sekvens data er udført på en standardiseret måde. Tilgængeligheden af egnede og tilstraekkelige patient materiale og timingen af prøveudtagning bør ikke have indflydelse på evnen til at udføre IG gen mutationsmønstre analyse, da testen kan udføres på PB og på enhver proeve med en høj CLL tumor celletal. Adskillelse af mononukleære celler ved hjælp af gradient adskillelse metoder er rutinemæssigt udføres i laboratorier, der diagnosticerer, og som altid, der bør udvises forsigtighed ved tilføjelse af blod/RPMI løsning til det rør, som indeholder gradient; denne opgave bør udføres i en langsom, blid måde for at undgå at forstyrre gradueringen og forhindre tab af celler.
Efter celleseparering udpakkes nukleinsyrer. Både gDNA og cDNA er egnet til SHM analyse af clonotypic indvendige Gearnav omlejring, men der er fordele og ulemper til anvendelse af enten materiale. Arbejdsprocessen laboratorium forløber hurtigere når du bruger gDNA da ingen reverse transkription skal udføres før PCR-amplifikation. Det sagt, bruger gDNA som substrat for PCR kan resultere i forstærkningen af både produktive og uproduktive rearrangementer, som igen kan føre til yderligere hands-on laboratoriearbejde, dvs, rensning eller gel excision af flere PCR produkter og enkelte sekventering af alle rearrangementer. Når man sammenligner gDNA og cDNA tilgange, for sidstnævnte skal en reverse transkription trin udføres, før du fortsætter med PCR-amplifikation. Dog i dette tilfælde, for de fleste tilfælde vil kun produktive IG rearrangementer blive forstærket og efterfølgende sekventeret. Kun en enkelt PCR produkt bliver således renset og sekventeret, mens resultaterne fortolkning er mere ligetil.
Forstærkning effektivitet afhænger i høj grad kvaliteten af gDNA/cDNA, som bør vurderes ved hjælp af en følsom kvantificering metode og primere udnyttet. Primere bruges er afgørende for hele analyseproceduren, fordi den nøjagtige bestemmelse af SHM niveau kan kun opnås ved at forstærke den hele sekvensen af omarrangeret IGHV genet. En fuld længde omordning kan kun vurderes, hvis 5′ IGHV leder primere bruges, dermed begrunder de seneste henstillinger af ERIC for brug af leder primere27. Brugen af alternative primere, fører til forstærkning af ufuldstændig IGHV-IGHD-IGHJ-gen rearrangementer, passer ikke til IGHV gen mutationsmønstre analyse, og dermed frarådet kraftigt. Den eneste undtagelse vedrører sager, som gentagne gange giver negative resultater, når der IGHV leder primere og analyse af ny patient materiale er enten ikke muligt eller også gør ikke give resultater. Hvis brug af en anden patient prøve og/eller materiale (gDNA/cDNA) og forskellige primere sætter stadig fail til at producere en PCR produkt, mulige årsager kunne være at tumor celle byrden er for lavt, eller at lymfocytose skyldes ikke en CLL klon (i hvilket tilfælde den immunophenotype skal genevalueres). Primere, der anvendes til analysen skal altid fremgå af rapporten kliniske.
Som CLL skyldes ophobning af monoklonale B celler forsynet med den samme IGHV-IGHD-IGHJ-gen omlejring, vil vurderingen for langt de fleste tilfælde clonality afsløre en unik monoklonale peak, dvs, en enkelt klon. I sjældne tilfælde kan dobbelt rearrangementer eller endda oligoklonale mønstre observeres35. I sådanne tilfælde gelelektroforese er ikke den foretrukne teknik til clonality vurdering og bør anvendes mere følsomme metoder såsom fragment analyse. Når clonality er blevet bekræftet, vedrører det sidste skridt før sekventering oprensning af PCR-produkt for at sikre, at sekvenser af høj kvalitet opnås. Endelig, værktøjet IMGT/V-QUEST er den ressource anbefalet for IG Sekvensanalyse af ERIC. Som IMGT databaser er konstant opdateret og rapportere resultater på en konsekvent og godt kommenteret måde, dette værktøj sikrer standardiseret analyse og letter sammenlignende analyse blandt forskellige kliniske eller akademiske faciliteter.
Immunogenetic analyse i CLL har prognostiske og, navnlig intelligent konsekvenser, robust analyse af IGHV-IGHD-IGHJ-gen omlejring herunder tildelingen til store CLL stereotype delmængder, er ikke længere kun ønskeligt, men af afgørende betydning. Dette er særlig tydeligt i denne æra af roman therapeutics og potentiale, IG gen analyse er at guide behandling beslutninger5,21,22,23,36,37 ,38, som officielt fremgår af den seneste opdatering af NCI-sponsoreret retningslinjerne fra den internationale Workshop på CLL24. At sagde, strenge standarder er berettiget, især da bestemmelse af SHM status for clonotypic omarrangeret IGHV gen i CLL patienter er ikke en bagatel og indebærer en multi-step proces. Vigtigst af alt, visse eksperimenterende trin, især valget af primere, udbytte overlegne resultater når specifikke indstillinger og/eller tilgange overholdes, andre tekniske aspekter er indstillet til en vis grad af fleksibilitet, som materialevalg eller den metode til vurdering af clonality, at de fører til subtile forskelle, hvis nogen, for så vidt angår de endelige resultater.
I det sidste årti, ERIC har bestræbt sig på at fremme standardisering og harmonisering af forskellige metoder, der er relevante for CLL diagnosticering og prognosticering. Dette afspejles i de offentliggjorte anbefalinger og retningslinjer for immunogenetic analyse27,34, talrige organiserede pædagogiske værksteder og arrangementer, oprettelsen af en IG netværk samt et ekspertforum til diskutere og vejlede om IG gen ordne i rækkefølge fortolkning i CLL. Det overordnede mål med ERIC gennem disse handlinger er at fremme optimal klinisk forvaltning og patientpleje. Trods intense bestræbelser, denne opgave er langt fra afsluttet, og faktisk er blevet mere kompleks som følge af udviklingen af nye høj overførselshastighed sekventering sigter immun profilering. Ikke desto mindre, selv om stadig udfordringer forude, intensive bestræbelser for robust standardisering af IG-gen analyse i CLL fortsat og er i øjeblikket genstand for igangværende aktiviteter inden for ERIC.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker nuværende og tidligere medlemmer af vores forskningsgrupper, den IgCLL og ERIC, for deres engagement og begejstring i at studere immunogenetics i CLL. Vi vil også gerne anerkende et tillidsfuldt samarbejde mellem alle medlemmer af IMGT/CLL-DB-initiativet og i særdeleshed, Professor Marie-Paule Lefranc og Dr Veronique Giudicelli, Laboratoire d’Immunogenetique Moleculaire, LIGM, Université Montpellier II, Montpellier, Frankrig, og IMGT, den internationale ImMunoGeneTics informationssystem, for deres enorme støtte og hjælpe med IG gen Sekvensanalyse. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra TRANSCAN-179 roman JTC 2016; Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant #20246 og særlige Program molekylære klinisk onkologi-5 promille #9965), Milano, Italien; Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) #2015ZMRFEA, MIUR, Rom, Italien; Svenske Kræftens Bekæmpelse, det svenske Forskningsråd, Knut og Alice Wallenberg Foundation, Karolinska Institutet, Uppsala Universitet, Uppsala University Hospital og Lion’s Cancer Research Foundation, Uppsala; ODYSSEUS-programmet, gennemføres i henhold til den “Action for the strategisk udvikling på the forskning og teknologiske sektor”, finansieret af det operationelle program “Konkurrenceevne, iværksætteri og Innovation” (nationale strategiske referenceramme 2014-2020) og samfinansieret af Grækenland og Den Europæiske Union (den europæiske regionale Udviklingsfond).
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper | ThermoFisher scientific | 02-689-4 | material storage |
BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube – Sodium Heparin | Becton Dickinson | 362753 | material storage |
BD Vacutainer Heparin Blood Collection Tubes FAQ | Daigger Scientific | 366480 | material storage |
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575038 | cell processing |
Centrifuge tubes 15 mL CS500 | Corning | 352096 | cell processing |
Centrifuge tubes PP 50 mL CS500 | Corning | 352070 | cell processing |
RPMI Medium 1640 (1X) liquid | Invitrogen | 21875-091 | cell processing |
Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL | STEMCELL Technologies | 17-1440-02 | cell processing |
Serological pipettes 5 mL | Sarstedt | 861,253,001 | cell processing |
Serological pipettes 10 mL | Sarstedt | 861,254,001 | cell processing |
Serological pipettes 25 mL | Sarstedt | 861,685,001 | cell processing |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) | Invitrogen | 14190250 | cell processing |
Neubauer plate | Marienfeld-Superior | 640010 | cell processing |
Tuerk solution | Sigma-Aldrich | 93770 | cell processing |
PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K1820-01 | DNA extraction |
QIAamp RNA Blood Mini Kit | Qiagen | 52304 | RNA extraction |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction |
5X first-strand buffer | Invitrogen | P/N Y02321 | cDNA synthesis |
Random Primers, 20 µg | Promega | C1181 | cDNA synthesis |
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777019 | cDNA synthesis |
DTT | Invitrogen | P/N Y00147 | cDNA synthesis |
SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | cDNA synthesis |
10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | cDNA synthesis, PCR |
PCR Buffer | Invitrogen | O00065 | PCR |
MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) | ThermoFisher scientific | AB0359 | PCR |
Taq DNA Polymerase, recombinant | Invitrogen | 10342-020 | PCR |
Applied Biosystems 5′ Labeled Primers | ThermoFisher scientific | – | PCR/Clonality assessment |
Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | PCR product quantification |
UltraPure TBE Buffer, 10X | ThermoFisher scientific | 15581044 | gel electrophoresis |
UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | ThermoFisher scientific | 15585011 | gel electrophoresis |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher scientific | S33102 | gel electrophoresis |
10X BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 16500100 | gel electrophoresis |
DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use | Geneon | 305-105 | gel electrophoresis |
UltraPure Agarose | ThermoFisher scientific | 16500500 | gel electrophoresis |
Agarose low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414-250G | gel electrophoresis |
Novex TBE Gels, 10%, 10 well | ThermoFisher scientific | EC6275BOX | gel electrophoresis |
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | ThermoFisher scientific | 78201.1.mL | PCR product clean-up |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | PCR product clean-up |
GenomeLab DTCS Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | Sanger sequencing |
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 | ThermoFisher scientific | R1181 | Sanger sequencing |
Glycogen, molecular biology grade | ThermoFisher scientific | R0561 | Sanger sequencing |
Ethanol absolute | EMD Millipore | 1024282500 | Sanger sequencing |
SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72,706 | general use |
Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP | Sarstedt | 72,737,002 | general use |
Centrifuge | equipment | ||
PCR machine | equipment | ||
Bioanalyzer | Agilent Technologies | equipment |