我们提出了一种非接触微操作系统泡的技术, 利用局部钙离子梯度。在巨大的脂质囊的附近注射钙离子溶液, 用于重塑脂质膜, 导致膜管状突起的产生。
在多种基本细胞过程中, 如膜的贩运和细胞凋亡, 细胞膜形态的转变同时发生于钙离子浓度的局部变化。确定了这些过程中所涉及的主要分子成分;然而, 钙离子梯度与细胞膜内脂质之间的具体相互作用远不为人所知, 主要是由于生物细胞的复杂性质和观察方案的困难。为了弥合这一缺口, 成功地实施了一种合成方法, 以揭示钙离子对细胞膜模拟剂的局部作用。建立一个类似于细胞内条件的模拟是一个几倍的问题。首先, 需要一个适当的维度和膜组成的适当的仿生模型来捕获细胞的物理特性。其次, 需要一个微操作系统设置, 以提供少量的钙离子到一个特定的膜位置。最后, 需要一个观察方案来检测和记录脂质膜对外界刺激的反应。本文提供了一个详细的仿生方法来研究钙离子膜相互作用, 其中一个脂囊系统, 包括一个巨大的 unilamellar 囊 (老爹) 连接到一个 multilamellar 囊 (MLV), 暴露在局部钙使用显微注射系统形成的梯度。用荧光显微镜观察了离子对膜的影响动力学, 并记录了视频帧率。由于膜刺激, 高弯曲膜管状突起 (台胞) 形成内部的老大, 面向远离膜。所述方法以完全非接触性和控制性的方式诱导脂质膜和中期生产的重构。该方法介绍了一种处理钙离子膜相互作用细节的方法, 为研究细胞膜整形机制提供了新的途径。
钙离子在生物过程中的作用, 特别是它们参与信号、细胞分裂和膜融合, 是许多机械学研究的重点1。胞内胞浆钙离子浓度为 100 nM, 而细胞器中的钙, 如内质网、分泌囊泡、线粒体等, 均达到 millimolars 浓度的水平。这将产生陡峭的钙离子浓度梯度级阶横跨胞内膜2,3,4,5,6,7,8 ,9。胞外钙离子水平约为2毫米, 因此, 钙离子浓度的变化发生在细胞外和细胞内的水平。此外, 最近的研究提供证据表明, 细胞内钙离子信号事件和神经元活动可能发生在局部波动的细胞外钙离子浓度, 表明同步的重要性细胞内和胞外钙离子变异10。
为了了解钙离子与生物膜的相互作用, 本文成功地实现了用脂质双层泡代替本机细胞膜的合成方法。将囊泡暴露在钙离子溶液中会导致脂质头组和烃链填料的变化, 膜张力增加, 囊泡聚集, 以及脂质和膜相转变11,12 的分离. ,13,14,15,16。利用 X 射线、 1h-核磁共振、光谱或热力学研究11、16等实验技术, 研究了脂质膜暴露于钙离子时的性质,17,18. 在这些研究中, 膜的组成经常被调整为类似于本机细胞膜, 含有磷脂酰胆碱 (PC)、脑磷脂 (PE) 和磷脂 (PS) 等生理脂质。PS 在人工囊泡制备中特别重要, 因为它是许多细胞过程中必不可少的成分, 包括胞内膜的贩运、胞吐作用和凋亡19、20。
合成脂囊的大小通常从纳米到几微米不等。在不同的囊泡制剂中, 巨大的 unilamellar 囊 (GUVs), 其直径为数微米, 特别重要, 因为它们的体积相对较大, 与单个细胞的尺寸紧密相似21,22,23. GUVs 的可用表面积使局部化学梯度对膜生物物理特性的影响得以研究。通过将部分膜表面暴露给外部刺激, 可以对膜动力学进行更深入的研究。例如, 已经表明, 化学或 pH 梯度在 GUVs 表面的局部应用导致管状突起的形成, 在散装暴露24,25没有观察到。在膜行为上观察到的差异要求进一步的方法发展单囊的审讯计划, 以获得一些对细胞膜重塑机制的深入了解。
建立在从 1900s26,27早期的显微注射和微操作系统的方法, 与最近的进展, 单囊泡操作方案从 2000s23,28, 本文提出了用钙离子的局部应用来生成台胞膜中膜管状突起 () 的膜重构和形成方法。
我们的方法利用一个囊状复合体, 由一个与 multilamellar 囊 (MLV) 连接的老爹作为仿生膜模型系统 (图 1A)。MLV 被要求作为一个脂质的水库为复合体提供脂质材料给老大在接触到钙离子梯度。这种连接使得复合体能够补偿在诱导重塑和人的心房形态转换过程中膜张力的增加, 为中期生长提供脂质。此外, MLV 有助于表面固定化, 因为它的质量比老大的大。MLV 配合物, 当固定在一个坚实的基底上, 以前曾用于生产管状囊泡网络, 研究聚合物膜相互作用, 并模仿胞吐作用29,30后期阶段, 31,32,33。
以前的协议利用大豆极性脂质提取物 (SPE) 制备 MLV 配合物28。SPE 包括了磷脂的混合物, 包括 PC (45.7%), PE (22.1%), 磷酸肌醇 (PI, 18.4%), 磷脂酸 (PA, 6.9%), 和其他脂 (6.9%) 的混合物。在本协议中, SPE 混合物掺入20% 的 12-dioleoyl-磷脂酰-3-磷-l-丝氨酸 (钠盐) (扣), 以模拟细胞膜的内小叶。另外1% 的阿托 488-1, 2-dioleoyl 锡-磷脂酰 3-乙醇胺 (ATTO488-DOPE) 被用来染色脂双层, 使监测膜重塑使用荧光显微镜。GUVs 在双层中有对称的脂质成分, 并且在当地暴露于5毫米的氯化钙浓度 (CaCl2)。这种实验条件下, 钙离子浓度升高, 也模仿凋亡细胞外膜小叶, 其中 PS 分子表达34。MLV 配合物的形成需要使用 Criado 和凯勒35最初开发的改良的补液脱水方法。囊泡制备协议包括形成一个干脂层, 然后用来在溶液中形成小泡。这个解决方案然后脱水和水化形成最终的 MLV 复合体。图 2AD说明了准备典型的 MLV 复合体的主要步骤。
囊泡制剂完成后, 囊泡复合物固定在玻璃基板上, 采用微注射技术, 通过开尖端玻璃微, 将少量钙离子输送到老爹的外小叶中。在头膜表面, 钙溶液的流动产生了局部钙离子梯度, 导致膜的重塑和台胞的产生。台胞的方向远离钙离子源, 并在老大体内生长。这一中期计划的形成可以直接监测使用荧光显微镜和记录使用数码相机。图 3显示了用于产生膜重塑的实验装置。在本协议中, 台胞 (图 2E和图 4) 的形成表明了在大体积条件下进行的钙离子暴露实验的对比结果。在散装条件下, GUVs 破裂和形成膜补丁, 可以观察到坚持玻璃表面25。
本文还详细介绍了 MLV 配合物的形成, 以及对钙离子进行显微注射的程序。这些协议主要集中在钙离子显微注射;然而, 这种方法可以很容易地被修改, 以用于研究膜反应由于局部接触其他离子或蛋白质。此外, 在膜重构过程中, 可以调节囊泡的组成, 以分离脂质成分的作用。所提出的协议不需要任何复杂的设备来生产 MLV 配合物, 具有高度的重现性。
仿生细胞系统允许研究膜的行为后, 暴露在外部刺激, 如离子, 蛋白质, 或纳米粒子。GUVs 是这样一个模型, 可以通过调整形状来响应化学环境的变化, 这通常涉及管状结构的形成和内陷24、41、42、43.
本文提供了一种在非接触方式下产生台胞的方法, 通过在表面注入钙离子的情况下, 通过重塑老大表面。该协议描述了 MLV 复合体的制备, 它模仿细胞等离子膜, 以及如何使用微注射技术产生接近老爹表面的钙离子梯度形成台胞。以往的大多数实验研究, 解决钙离子膜的相互作用暴露脂囊泡到大块钙离子浓度14,17。根据实验条件, 这种大块接触可能导致不同的膜反应, 没有管状突起形成25。
MLV 配合物的形成是相当简单的, 只需要标准的实验室设备, 如旋转蒸发器、超声波浴和真空干燥。不过, 在囊泡准备过程中还有几个关键步骤需要考虑。重要的是要确保囊泡的脱水是完整的 (在协议的步骤 2.3) 和一个只含有少量盐晶体的干循环脂膜在玻璃盖板的表面形成。在实验过程中, 用氯仿中的新鲜脂质溶液和新鲜的 HEPES 缓冲液对囊泡溶液进行细致的处理, 对 MLV 配合物的成功制备至关重要。此外, 安全附着 MLV 复合物的玻璃覆盖滑移面是至关重要的微操作系统和显微注射。为了确认 MLV 复合体的足够附着力, 微 (不带喷射流) 可以用来轻轻地推向老大表面。牢固附着的囊泡不会沿表面滑动直接接触。由于实验是在一个开放的缓冲液滴, 这可能被审问几个小时, 必须考虑蒸发。从缓冲液滴蒸发将改变渗透条件, 这可能会影响和稳定的囊泡。为了恢复渗透条件, 定期向样品中添加纯净水还原原体积, 使系统恢复稳态。
在修改脂质膜成分时, 关键是以 MLV 复合体的形式产生囊泡, 因为 MLV 允许在膜整形过程中将脂质材料转移到老爹身上。以前的研究表明, 用纯脂代替 SPE 混合物的成分, 或者增加5-30% 的胆固醇, 也允许 MLV 复杂的形成28,44。被准备的 GUVs 的多数是 unilamellar45。
此外, 当测试其他价阳离子, 如镁离子, 台胞的形成严重依赖于存在的负电荷扣在脂质混合物。没有扣, 台胞在本议定书所描述的囊泡中不形成。此外, 单价阳离子, 如钾和钠, 不会导致台胞的形成, 即使在含扣的囊泡25。
除了在 GUVs 的准备和操作方面的关键步骤外, 还有几个重要的因素需要考虑在注射过程中。成功地显微注射钙离子严重依赖于正常运行的玻璃 micropipettes, 这是在实验当天准备。有几个因素可能导致微的故障。一个常见的原因是堵塞的提示打开。小的脂质微粒, 是囊泡制剂的副产品, 分散在溶液中, 倾向于坚持微尖端, 从而产生堵塞。清洁吸管尖端最好的方法是把它从囊泡溶液中抬起, 然后放回靠近老大的表面。必须避免使用微注射泵的吹出功能, 因为它会导致大量的钙离子注入到散装溶液中。此外, 微内包裹的小气泡防止了适当的显微注射, 在这种情况下, 微应该换成新的。通过将实验装置放置在减震工作台上, 最大限度地减少尖端的振荡, 可以显著减少尖端断裂。
此外, 在选择观察方案时需要注意, 尽量减少漂白, 同时获得最佳的时间分辨图像。本协议采用了广域激光诱导荧光显微术, 因为它允许在目标有限探针深度上获得相对较高的图像采集速率。此外, 使用倒置显微镜可以同时注射和观察脂囊和台胞。
提出的方法的主要局限性之一是广泛的手工工作和足够的微操作系统技能的要求。由于复合体是通过自发的膨胀过程形成的, GUVs 和 MLVs 的大小是无法控制的。此外, 本议定书不允许控制准备好的 MLV 复合体的膜张力, 这可能是必要的, 以收集有关膜重塑的更多细节。GUVs 与 MLVs 连接, 后者提供脂质材料, 用于台胞的大量生长, 在一定程度上无法完全利用从 GUVs 获得的膜。MLVs 还有助于降低 MLV 复杂44内的任何侧向表面张力变化, 这将使试图通过微吸入控制囊泡的张力复杂化。这种基于 MLV 的模型确实提供了一种更低的张力, 可以更好地模拟与膜油藏相连的细胞膜结构中所发现的张力机制, 如膜褶皱和内陷46。同时, 微抽吸技术可以成功地应用于单 GUVs 膜张力的控制。例如, 格雷勃等人的工作提供了关于单 GUVs 中的膜管状内陷的形成的详细情况, 在不同张力状态下, 在散装条件下将钙离子与膜结合在一起。最后, 在局部和大量接触钙的情况下, 膜的行为的比较需要改进对表面的膜黏附力的控制, 这超出了本协议的范围。
综上所述, 所提出的技术允许非接触膜重塑和形成的台胞在局部刺激钙离子。该方法的未来应用中心的翻译从合成囊泡系统到当地的生物膜, 如细胞泡。所提出的方法可以与其他单细胞审讯方案, 如补丁钳或微电极探头, 或结合局部加热策略31,47,48。测试其他离子或分子的效果是直接的, 只需要用感兴趣的分子来代替钙离子。此外, 复杂的合成脂泡可以通过膜功能化的跨膜蛋白产生, 这可能扩大我们对细胞重塑的生物物理学和细胞膜动力学的认识, 与当地的传感相关化学梯度。最后但并非最不重要的是, 非接触性刺激的脂质膜也可以转化为高分子软物质系统, 为新的非接触操作平台提供了基础。
Soy bean polar lipid extract | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
541602C | 100 mg |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
840035C | 1×25 mg |
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | ATTO-TEC (Germany) | AD 488-31 | 1 mg |
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 20735 SIGMA-ALDRICH | |
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10×75 mm, Borosilicate glass 250/pack | Corning Incorporated (Corning, NY 14831) | 99445-10 | |
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 650498-1L-D | |
Rotary evaporator | Büchi Rotavapor R-144 Switzerland | ||
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm | KEBO lab (Sweden) | MA00360500 | |
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO | Sharlau Chemie S.A. (Spain) | P9333-500G | |
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | S7653-1KG | |
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | G5516-1L | |
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | T-1503 2050 g | |
Trizma base | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5629-500G | |
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5655 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 5886 | |
MgSO4 | Merck (USA) | 34549-100 g | |
EDTA | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | H0887 Sigma | |
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | Z260282-1PAK | 24×60 mm |
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 631-1339 | |
Menzel Gläzer #1, glass cover slip | VWR (USA) | ||
Diaphragm vacuum pump for the desiccator | Vacuubrand (Germany) | ||
Ultrasonicate bath | Bandelin Sonolex (Germany) | ||
VX-100 Lab vortexer vortex mixer | Labnet International (USA) | ||
488 nm laser line | Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden) | ||
Leica Microsystems immersion oil for microscopes | Leica (Germany) | 12847995 | |
Inverted fluorescence microscopy system | Leica DM IRB (Wetzlar, Germany) | ||
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) | Technologies GmbH (Thuringia, Germany) | 300038 | |
PatchStar Micromanipulator | Scientifica (Uckfield, UK) | 612-7933 | |
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10, 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. | Harvard Apparatus U.K | ||
Eppendorf microloader (pipette tips) | VWR (USA) | ||
P-2000 CO2 laser-puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | ||
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet | Eppendorf (Germany) |