Presentiamo una tecnica di micromanipolazione senza contatto delle vescicole, usando le pendenze dello ione calcio localizzata. Microiniezione di una soluzione di ioni di calcio, in prossimità di una vescicola gigante del lipido, è utilizzato per rimodellare la membrana lipidica, con conseguente produzione di tubolari protrusioni di membrana.
In un’ampia varietà di processi cellulari fondamentali, come il traffico di membrana e apoptosi, membrana cellulare forma transizioni si verificano in concomitanza con variazioni locali nella concentrazione di ioni calcio. I principali componenti molecolari coinvolti in questi processi sono stati identificati; Tuttavia, l’interazione specifica fra pendenze dello ione del calcio ed i lipidi nelle membrane cellulari è molto meno noto, principalmente a causa della natura complessa delle cellule biologiche e la difficoltà dei regimi di osservazione. Per colmare questa lacuna, un approccio sintetico viene implementato con successo per rivelare l’effetto localizzato di ioni calcio sulla membrana cellulare imita. Che istituisce un mimo per assomigliare le condizioni all’interno di una cella è un problema molteplice. In primo luogo, un modello adeguato biomimetici con adeguate dimensioni e composizione della membrana è necessaria per acquisire le proprietà fisiche delle cellule. In secondo luogo, un programma di installazione di micromanipolazione è necessaria per fornire una piccola quantità di ioni calcio a una posizione di particolare membrana. Infine, un regime di osservazione è necessaria per rilevare e registrare la risposta della membrana del lipido per la stimolazione esterna. Questo articolo offre un approccio biomimetico dettagliate per studiare l’interazione di membrana dello ione del calcio, dove un sistema di vescicola del lipido, costituito da una vescicola unilamellari gigante (GUV) collegata ad delle vescicole multilamellari (MLV), è esposto a un calcio localizzato sfumatura formata utilizzando un sistema di microiniezione. Le dinamiche dell’influenza ionica sulla membrana erano osservate mediante microscopia a fluorescenza e registrate a video frame rate. Come risultato la stimolazione della membrana, altamente curvo protrusioni di membrana tubolare (MTPs) formate dentro il capo, orientato dalla membrana. L’approccio descritto induce il rimodellamento della membrana del lipido e della produzione di MTP in modo interamente senza contatto e controllato. Questo approccio introduce un mezzo per affrontare i dettagli delle interazioni di membrana dello ione calcio, fornendo nuove strade per lo studio dei meccanismi di rimodellamento della membrana cellulare.
Il ruolo degli ioni calcio all’interno di processi biologici, in particolare il loro coinvolgimento nella segnalazione, la divisione cellulare e la fusione della membrana, è al centro di molti studi meccanicistici1. La concentrazione di ioni di calcio intracellulare citoplasmatica è dell’ordine di 100 nM, mentre il calcio in organelli, come il reticolo endoplasmatico, vescicole secretorie e mitocondri, raggiungere livelli fino a decine di millimolars in concentrazione. Questo crea ioni calcio ripido gradiente di concentrazione ordini di grandezza attraverso le membrane intracellulari2,3,4,5,6,7,8 ,9. Il livello di ioni di calcio extracellulare è di circa 2 mM e, pertanto, le variazioni della concentrazione di ioni calcio generato a livello extracellulare e intracellulare. Inoltre, recenti studi forniscono la prova quello ione calcio intracellulare segnalazione eventi e attività di un neurone può verificarsi nelle condizioni di locali fluttuazioni delle concentrazioni di ioni di calcio extracellulare, che indica l’importanza di sincronizzato intra – ed extracellulari del calcio ioni variazioni10.
Con l’obiettivo di comprendere l’interazione tra ioni di calcio e membrane biologiche, un approccio sintetico in cui native membrane cellulari vengono sostituite con vescicole bilayer del lipido è stata implementata con successo. Esponendo le vescicole a soluzioni di ioni di calcio conduce ai cambiamenti in gruppi testa del lipido e imballaggio catena dell’idrocarburo, membrana aumentata tensione e l’aggregazione della vescicola, nonché la segregazione dei lipidi e membrana fase transizione11,12 ,13,14,15,16. Le proprietà delle membrane del lipido sopra l’esposizione di ioni di calcio sono state studiate utilizzando tali tecniche sperimentali come raggi x, 1H-NMR e studi spettroscopici o termodinamica11,16, 17 , 18. in questi studi, la composizione della membrana è spesso sintonizzata per assomigliare nativo delle membrane cellulari e contiene tali lipidi fisiologici come fosfatidilcolina (PC), phosphatidylethanolamine (PE) e fosfatidilserina (PS). PS è particolarmente importante nella preparazione della vescicola artificiale perché è una componente essenziale in molti processi cellulari, tra cui traffico di membrane intracellulari, esocitosi e apoptosi19,20.
Le dimensioni delle vescicole lipidiche sintetizzato spesso variano da nanometri a parecchi micrometri. Tra le preparazioni differenti della vescicola, vescicole unilamellari gigante (GUV), che sono diverse decine di micrometri di diametro, sono di particolare importanza a causa delle dimensioni relativamente grandi, molto somiglianti le dimensioni dell’individuo cellule21 , 22 , 23. la superficie disponibile del Guv consente l’effetto di gradienti chimici locali sulla proprietà biofisiche della membrana per essere studiato. Esponendo solo una parte della superficie della membrana agli stimoli esterni, è possono analizzare più da vicino le dinamiche di membrana. Ad esempio, è stato indicato che l’applicazione localizzata di gradienti chimici o pH alla superficie del Guv conduce alla formazione di sporgenze tubolari, che non sono stati osservati a massa l’esposizione24,25. Le differenze osservate nel comportamento di membrana chiamano per ulteriore sviluppo del metodo dei regimi di singolo-vescicola interrogatorio per ottenere alcune comprensioni nei meccanismi di rimodellamento della membrana cellulare.
Basandosi su metodi di microiniezione e micromanipolazione dai primi del 190026,27, in relazione più recenti avanzamenti di schemi di manipolazione di singolo-vescicola dal 2000s23,28 , questo articolo presenta un approccio in cui membrana rimodellamento e formazione di protrusioni di membrana tubolare (MTPs) nella membrana GUV vengono generati in risposta all’applicazione locale di ioni calcio.
Il nostro approccio utilizza una vescicola complessa composto da un GUV collegato ad delle vescicole multilamellari (MLV) come un sistema di modello di membrana biomimetici (Figura 1A). Il MLV è richiesto come un serbatoio di lipidi per il complesso per la fornitura di materiale lipidico per la GUV durante l’esposizione a un gradiente di ioni calcio. Questa connessione consente il complesso compensare l’aumento di tensione della membrana durante il ritocco indotta e forma la transizione della membrana GUV e fornire lipidi per crescita MTP. Inoltre, il MLV facilita l’immobilizzazione superficiale poiché la sua massa è maggiore rispetto a quella del GUV. I complessi GUV-MLV, quando immobilizzati su un substrato solido, precedentemente sono stati usati per produrre reti di nanotube-vescicola, studiando l’interazione polimero-membrana e che imita la fine delle fasi di esocitosi29,30, 31,32,33.
Precedenti protocolli utilizzati Estratto di soia dei lipidi polari (SPE) per preparare GUV-MLV complessi28. SPE è costituito da una miscela di fosfolipidi che includono PC (45,7%), PE (22,1%), fosfatidilinositolo (PI, 18,4%), acido fosfatidico (PA, 6,9%) e una miscela di altri lipidi (6,9%). Nel nostro protocollo nel presente documento, la miscela SPE è drogata con 20% di 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sale di sodio) (DOPS) per simulare l’opuscolo interno della membrana plasmatica delle cellule. Un ulteriore 1% di ATTO 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-DOPE) viene utilizzato per macchiare il doppio strato lipidico per attivare il monitoraggio del rimodellamento della membrana mediante microscopia a fluorescenza. Il GUV hanno composizione lipidica simmetrica attraverso il doppio strato e localmente sono esposti a concentrazioni di 5 mM di cloruro di calcio (CaCl2). Tali condizioni sperimentali, con una concentrazione di ioni di calcio elevato, anche imitano l’opuscolo della membrana esterna delle cellule apoptotiche, dove le molecole di PS sono espressi34. La formazione dei complessi GUV-MLV richiede l’uso di un metodo di modifica per la reidratazione-disidratazione inizialmente sviluppato da Criado e Keller35. Il protocollo di preparazione della vescicola include la formazione di uno strato di lipidi asciutto, che viene quindi utilizzato per formare piccole vescicole in soluzione. Questa soluzione è poi disidratata e reidratata per formare i complessi GUV-MLV finali. Figura 2A -D illustra i passaggi principali per la preparazione di un tipico complesso di GUV-MLV.
Dopo la preparazione della vescicola è completata e la vescicola complessa è immobilizzata sul substrato di vetro, la tecnica di microiniezione viene usata per fornire piccole quantità di ioni calcio all’opuscolo esterno della GUV attraverso una micropipetta di vetro open-tip. Il flusso della soluzione di calcio dalla punta genera un gradiente di ioni calcio localizzato sulla superficie di membrana GUV, che conduce al rimodellamento della membrana e la generazione del MTPs. Il MTPs sono orientati lontano dalla sorgente di ioni di calcio e crescere all’interno del capo. Questa formazione di MTP può essere monitorata direttamente mediante microscopia a fluorescenza e registrato utilizzando una fotocamera digitale. La figura 3 Mostra l’apparato sperimentale utilizzato per produrre il rimodellamento della membrana. La formazione di MTPs (Figura 2E e Figura 4) in questo protocollo viene illustrato un risultati contrastanti a calcio ione esposizione esperimenti eseguiti in condizioni di traffico di massa. In condizioni di massa, il GUV rompersi e formare le patch di membrana che possono essere osservate ad per aderire al vetro superficie25.
Ulteriori dettagli sulla formazione di complessi GUV-MLV, nonché la procedura per eseguire la microiniezione degli ioni calcio, sono spiegati in questo articolo. I protocolli sono principalmente focalizzati su microiniezione di ioni di calcio; Tuttavia, questo approccio può essere facilmente modificato per uso nello studiare le risposte di membrana dovuto l’esposizione locale ad altri ioni o proteine. Inoltre, la composizione delle vescicole può essere sintonizzata per isolare i ruoli di componente lipidica nel processo di rimodellamento della membrana. Il protocollo presentato non richiede sofisticate attrezzature per produrre i complessi GUV-MLV ed è caratterizzato da un elevato grado di riproducibilità.
Sistemi biomimetici cella consentono lo studio del comportamento della membrana dopo l’esposizione agli stimoli esterni quali gli ioni, proteine o nanoparticelle. Guv, essendo tale modello, può rispondere alle alterazioni nell’ambiente chimico regolando la loro forma, che spesso coinvolge la formazione di tubolari strutture e i invaginations24,41,42,43 .
Questo articolo offre un approccio per generare MTPs in modo statico tramite rimodellamento della superficie GUV sulliniezione localizzata degli ioni di calcio alla superficie GUV. Il protocollo descrive la preparazione del complesso GUV-MLV, che imita una membrana di plasma delle cellule, così come il modo di impiegare una tecnica di microiniezione per generare calcio gradienti ionici vicino il GUV in superficie per formare MTPs. La maggior parte degli studi sperimentali precedenti che affrontate interazioni membrana dello ione calcio esposta vescicole lipidiche di massa calcio ioni concentrazione14,17. A seconda delle condizioni sperimentali, tale esposizione di massa può provocare una risposta diversa membrana con nessun tubolare protrusioni formate25.
La formazione dei complessi GUV-MLV è piuttosto semplice e richiede solo la normale attrezzatura da laboratorio, come un evaporatore rotante, bagno ad ultrasuoni e un essiccatore sotto vuoto. Ancora, ci sono diversi passaggi critici da considerare durante la preparazione delle vescicole. È importante garantire che la disidratazione delle vescicole è completa (durante passaggio 2.3 del protocollo) e un film asciutto del lipido circolare contenente solo una piccola quantità di cristalli di sale è formato sulla superficie dello slittamento del coperchio di vetro. Durante l’esperimento, un’attenta gestione della soluzione della vescicola, utilizzando la soluzione di riserva fresco del lipido in cloroformio, nonché fresco tampone HEPES, è essenziale per la corretta preparazione dei complessi GUV-MLV. Inoltre, attaccamento sicuro del complesso GUV-MLV alla superficie di slittamento del coperchio di vetro è cruciale per micromanipolazione e microiniezione. Per confermare l’adesione adeguata di GUV-MLV complessi, la micropipetta (senza flusso di iniezione) può essere utilizzata per spingere delicatamente contro la superficie del capo. Una vescicola fermamente aderita non scivolerà lungo la superficie a diretto contatto fisico. Poiché gli esperimenti vengono eseguiti in una goccia di tampone aperto, che può essere interrogata per diverse ore, evaporazione deve essere preso in considerazione. Evaporazione dalla goccia di tampone cambierà le condizioni osmotiche, che potrebbero influenzare e destabilizzare le vescicole. Per ripristinare condizioni di osmotiche periodica aggiunta di acqua pura al campione per ripristinare il volume originale restituisce il sistema all’omeostasi.
Quando si modifica la composizione della membrana lipidica, è fondamentale che le vescicole sono prodotte in forma di un complesso di GUV-MLV perché il MLV permette di trasferire il materiale lipidico per la GUV durante il rimodellamento della membrana. Studi precedenti hanno dimostrato che la sostituzione dei componenti della miscela SPE con lipidi puri, o l’aggiunta di 5-30% di colesterolo, consente inoltre per la formazione del complesso GUV-MLV28,44. La maggior parte del Guv preparati è unilamellari45.
Inoltre, durante il test di altri cationi bivalenti, come gli ioni di magnesio, la formazione del MTPs pesantemente dipende dalla presenza di carica negativa DOPS nella miscela del lipido. Senza DOPS, il MTPs non formano nelle vescicole descritte nel presente protocollo. Inoltre, cationi monovalenti, come potassio e sodio, non provocare la formazione di MTPs, anche in DOPS contenenti vescicole25.
Oltre ai passaggi critici per quanto riguarda la preparazione e la manipolazione del Guv, ci sono diversi fattori importanti da considerare durante la procedura di microiniezione. Il successo microiniezione degli ioni del calcio si basa fortemente sul corretto funzionamento micropipette, che vengono preparate il giorno dell’esperimento di vetro. Ci sono diversi fattori che potrebbero causare la micropipetta malfunzionamento. Un motivo comune è un’apertura di punta intasato. Particelle lipidiche piccole, che sono sottoprodotti della preparazione della vescicola, sono dispersi nella soluzione e tendono ad aderire alla punta della micropipetta, generando così un intasamento. Pulire la punta della pipetta è fatto meglio di sollevarlo dalla soluzione della vescicola e l’immissione torna vicino alla superficie GUV. L’utilizzo della funzione blow-out della pompa microiniezione dovrà essere evitato perché si traduce in una massiccia iniezione di ioni di calcio nella soluzione all’ingrosso. Inoltre, piccole bolle d’aria intrappolate all’interno la micropipetta prevenire microiniezione corretto, nel quale caso la micropipetta deve essere sostituito con uno nuovo. Rottura di punta può essere minimizzato significativamente inserendo la messa a punto sperimentale su un tavolo sistema di smorzamento per ridurre al minimo le oscillazioni di punta.
Inoltre, cura deve essere presa quando si sceglie un regime di osservazione, per ridurre al minimo photobleaching mentre ottenere le migliori immagini risolta nel tempo. Microscopia di fluorescenza indotta da laser grandangolari è stata utilizzata nel presente protocollo perché consente una velocità di acquisizione immagine relativamente elevata ad una profondità di obiettivo limitato sonda. Inoltre, l’utilizzo della microscopia invertita consente simultaneo microiniezione e osservazione delle vescicole lipidiche e MTPs.
Uno dei limiti principali del metodo presentato è il requisito di vasto lavoro manuale e sufficienti competenze di micromanipolazione. Perché i complessi sono formati attraverso un processo spontaneo di gonfiamento, la dimensione del Guv e MLV non può essere controllata. Inoltre, questo protocollo non consente per il controllo della tensione della membrana dei preparati complessi GUV-MLV, che potrebbe essere necessario raccogliere ulteriori dettagli per quanto riguarda il rimodellamento della membrana. Il GUV sono collegati al QGBT con il materiale lipidico fornenti quest’ultima per la crescita sostanza della MTPs in una misura che sarebbe impossibile da realizzare utilizzando esclusivamente la membrana disponibile dal GUV. Il MLV anche contribuire a ridurre eventuali variazioni di tensione di superficie laterale all’interno il GUV-MLV complesso44, che complicherebbe i tentativi di controllare la tensione della vescicola mediante aspirazione micropipetta. Questo modello basati su GUV-MLV forniscono una tensione più bassa che imita meglio i regimi di tensione trovati nelle strutture di membrana cellulare connessi a bacini di membrana, come membrana pieghe e i invaginations46. Allo stesso tempo, la tecnica di aspirazione micropipetta può applicarsi con successo per controllare la tensione della membrana a singolo GUV. Ad esempio, il lavoro di Graber et al fornito dettagli sulla formazione dei invaginations tubolare di membrana a singolo GUV legandosi degli ioni del calcio alla membrana in condizioni di massa da tensione vari regimi40. Infine, il confronto tra il comportamento della membrana in esposizione alla rinfusa e locale di calcio richiede migliorato controllo dell’aderenza membrana alla superficie, che esula dall’ambito del presente protocollo.
Per riassumere, la tecnica proposta consente rimodellamento della membrana senza contatto e formazione di MTPs stimolazione localizzata con gli ioni calcio. Applicazioni future di questo centro di metodo alla traduzione da sistemi sintetici vescicola nativo delle membrane biologiche, come vescichette cella. Il metodo proposto può essere integrato con altri sistemi di singola cellula interrogatorio, come patch clamp o microelettrodo amperometria, o combinato con localizzato riscaldamento strategie31,47,48. Verificare l’effetto di altri ioni o molecole è semplice e consiste nel sostituire semplicemente gli ioni di calcio con le molecole di interesse. Inoltre, vescicole lipidiche complesse di sintetico possono essere prodotto attraverso funzionalizzazione di membrana con proteine transmembrana, che può espandere la nostra comprensione della biofisica delle dinamiche di rimodellamento e la membrana delle cellule delle cellule connesse con rilevamento del locale gradienti chimici. Ultimo ma non meno importante, la stimolazione senza contatto della membrana del lipido può anche essere tradotto ai sistemi polimerici materia soffice, che offre una base per una piattaforma di romanzo manipolazione senza contatto.
Soy bean polar lipid extract | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
541602C | 100 mg |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
840035C | 1×25 mg |
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | ATTO-TEC (Germany) | AD 488-31 | 1 mg |
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 20735 SIGMA-ALDRICH | |
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10×75 mm, Borosilicate glass 250/pack | Corning Incorporated (Corning, NY 14831) | 99445-10 | |
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 650498-1L-D | |
Rotary evaporator | Büchi Rotavapor R-144 Switzerland | ||
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm | KEBO lab (Sweden) | MA00360500 | |
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO | Sharlau Chemie S.A. (Spain) | P9333-500G | |
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | S7653-1KG | |
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | G5516-1L | |
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | T-1503 2050 g | |
Trizma base | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5629-500G | |
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5655 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 5886 | |
MgSO4 | Merck (USA) | 34549-100 g | |
EDTA | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | H0887 Sigma | |
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | Z260282-1PAK | 24×60 mm |
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 631-1339 | |
Menzel Gläzer #1, glass cover slip | VWR (USA) | ||
Diaphragm vacuum pump for the desiccator | Vacuubrand (Germany) | ||
Ultrasonicate bath | Bandelin Sonolex (Germany) | ||
VX-100 Lab vortexer vortex mixer | Labnet International (USA) | ||
488 nm laser line | Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden) | ||
Leica Microsystems immersion oil for microscopes | Leica (Germany) | 12847995 | |
Inverted fluorescence microscopy system | Leica DM IRB (Wetzlar, Germany) | ||
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) | Technologies GmbH (Thuringia, Germany) | 300038 | |
PatchStar Micromanipulator | Scientifica (Uckfield, UK) | 612-7933 | |
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10, 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. | Harvard Apparatus U.K | ||
Eppendorf microloader (pipette tips) | VWR (USA) | ||
P-2000 CO2 laser-puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | ||
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet | Eppendorf (Germany) |