Differentiatie, onderhoud en analyse van menselijke retinale Pigment epitheel cellen: een ziekte-in-a-schotel-Model voor BEST1 mutaties
Summary
Hier presenteren we een protocol om te onderscheiden van de retinale pigment epitheel (RPE) cellen van menselijke pluripotente stamcellen rekening houdend met patiënt afkomstige mutaties. De mutant cellijnen kunnen worden gebruikt voor functionele analyses, met inbegrip van immunoblotting, immunofluorescentie, en patch klem. Deze aanpak van ziekte-in-a-schotel omzeilt de moeilijkheidsgraad van het verkrijgen van inheemse menselijke RPE cellen.
Abstract
Hoewel meer dan 200 genetische mutaties in het menselijk BEST1 -gen zijn geïdentificeerd en gekoppeld aan retinale degeneratieve ziekten, blijven de pathologische mechanismen ongrijpbare voornamelijk te wijten aan het ontbreken van een goede in-vivo -model voor het bestuderen van BEST1 en zijn mutaties onder fysiologische omstandigheden. BEST1 codeert een ionkanaal, namelijk BESTROPHIN1 (BEST1), die werkt in de retinale pigment epitheel (RPE); echter vormt de uiterst beperkte toegankelijkheid aan inheemse menselijke RPE cellen een grote uitdaging voor wetenschappelijk onderzoek. Dit protocol beschrijft hoe te genereren van menselijke RPEs, rekening houdend met BEST1 ziekte-veroorzakende mutaties door geïnduceerde differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs). Als hPSCs zelf hernieuwbare zijn, deze aanpak kan onderzoekers hebben een constante bron van hPSC-RPEs voor verschillende experimentele analyses, zoals immunoblotting, immunofluorescentie, en patch-klem, en biedt dus een zeer krachtige model van het ziekte-in-a-schotel voor BEST1-netvlies voorwaarden verbonden. Met name kan deze strategie worden toegepast om te studeren RPE (patho) fysiologie en andere genen van belang native uitgedrukt in RPE.
Introduction
Het is gedocumenteerd die ten minste vijf retinale degeneratieve ziekten worden veroorzaakt door genetische mutaties in het BEST1 gen1,2,3,,4,5,6 , 7 , 8, met het aantal gerapporteerde mutaties al meer dan 200 en nog steeds groeiende. Deze BEST1-geassocieerde ziekten, ook bekend als bestrophinopathies, progressieve visie verlies en zelfs blindheid veroorzaken en er zijn momenteel geen doeltreffende behandelingen. Het eiwit product van BEST1, namelijk BESTROPHIN1 (BEST1), is een Ca2 +-geactiveerde Cl– -kanaal (CaCC) speciaal onder het retinale pigment epitheel (RPE) van de ogen5,6, uitgedruktin 8,9. Nog belangrijker is, een klinische fenotype van BEST1-geassocieerde ziekten is de verminderde visuele reactie op lichte stimuli, genaamd lichte piek (LP) gemeten in de electrooculogram10,11; LP wordt verondersteld te worden bemiddeld door een CaCC in RPE12,13,14. Om de pathologische mechanismen van BEST1 mutaties beter te begrijpen en te streven naar mogelijke therapieën, is het essentieel om te studeren van mutant BEST1 kanalen endogeen uitgedrukt in menselijke RPE cellen.
Verkrijgen van RPE cellen rechtstreeks uit levende patiënten echter zeer onpraktisch. Hoewel inheemse RPE cellen kunnen worden geoogst vanaf Biopten van menselijke kadavers en foetussen, beperkt de moeilijke toegang tot deze bronnen aanzienlijk wetenschappelijk onderzoek. Daarom is het essentieel dat alternatieve RPE bronnen dan menselijke ogen. Deze oproep is beantwoord door de recente vooruitgang in de cel van de stam technieken, zoals functionele RPE cellen nu van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), met inbegrip van embryonale stamcellen (hESCs) kunnen worden onderscheiden en pluripotente stamcellen (hiPSCs), de laatste geïnduceerde wordt gegenereerd door de herprogrammering van de primaire huid fibroblasten van donoren16,17,18. Nog belangrijker is, zorgen de zelf-vernieuwing en pluripotent van hPSCs voor een betrouwbare bron voor het genereren van RPEs, terwijl de patiënt-specificiteit van hiPSCs en het potentieel van de genomic wijziging van hESCs (bijvoorbeelddoor CRISPR) bieden een veelzijdige ziekte-in-a-schotel-model voor gewenste BEST1 mutaties.
hPSC-RPE heeft diverse voordelen ten opzichte van muizen RPE modellen: 1) BEST1 knock-out muizen worden niet weergegeven voor elk netvlies abnormaliteit19, verhogen van de mogelijkheid van verschillende genetische vereiste van BEST1 in RPE tussen muizen en mensen; 2) slechts 3% van menselijke RPE cellen zijn binucleate, in tegenstelling tot 35% in muizen20; 3) hiPSC-RPE potentiates autologe transplantatie in de klinische behandeling van retinale stoornissen21. Niettemin, dierlijke modellen zijn nog steeds onmisbaar voor het bestuderen van RPE fysiologie en pathologie in een live systeem en het oncogene potentieel van hiPSC mag niet worden genegeerd.
De procedure hier beschrijft een nuttig en matig eenvoudige hPSC RPE differentiatie protocol die kunnen worden gebruikt voor onderzoek en klinische doeleinden. Dit protocol gebruikt nicotinamide (vitamine B3) om te vergroten van differentiatie van hPSCs naar zenuwweefsel, die verder wordt veroorzaakt om te differentiëren in RPE door behandeling met activin-A. Nicotinamide behandeling is aangetoond dat het verhogen van het aantal gepigmenteerde cellen (een teken van differentiatie in RPE), eventueel door de activiteit van de apoptotic cellen22differentiëren verzachtende. De resulterende hPSC-RPE cellen weergeven de dezelfde belangrijke markeringen, geplaveide morfologie en cellulaire functionaliteit als inheemse menselijke RPE cellen22. Dus, in de instelling van een onderzoek, de resulterende hPSC-RPE cellen zijn geschikt voor downstream functionele analyses, met inbegrip van immunoblotting, immunokleuring en geheel-cel patch-klem, waarvoor gedetailleerde experimentele procedures zijn ook beschikbaar. RPE cellen afgeleid van stamcellen hebben klinisch, zowel dierlijke studies en menselijke proeven23zien groot potentieel voor transplantatie behandeling van macula degeneratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De belangrijkste procedure voor de ziekte-in-a-schotel-benadering is om te onderscheiden van hPSCs met een ziekte-veroorzakende mutatie naar de juiste cel bloedlijn, oftewel RPE voor BEST1. Dus, na elk experiment van differentiatie, de resulterende hPSC-RPE-cellen moeten worden zorgvuldig gevalideerd voor hun volwassen status RPE-specifieke morphologies en eiwit markeringen16,17,18. U wilt minimaliseren klonale artefact…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd gefinancierd door de NIH grants EY025290, GM127652 en Universiteit van Rochester start-up financiering.
Materials
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
