用 Widefield 荧光显微镜研究软硅基美国匹茨堡的刚度测量
Summary
kilopascal 范围内的刚性基底对于研究细胞对生理相关的微环境刚度的反应是有益的。使用一个 widefield 荧光显微镜, 年轻的软硅胶凝胶的弹性模量可以确定使用一个合适的球压痕。
Abstract
人体软组织通常在 kilopascal (kPa) 范围内有刚度。因此, 硅胶和水凝胶柔性基质已被证明是有益的基质, 培养细胞在物理微环境中, 部分模拟体内条件。在这里, 我们提出了一个简单的协议, 以表征杨氏模量的各向同性线性弹性基板通常用于美国匹茨堡研究。该协议包括在培养皿或硬硅树脂上制备软硅基板, 用荧光珠涂覆硅基板的顶面, 使用毫米级球体缩进顶面 (按重力), 成像荧光用荧光显微镜对缩进硅胶表面上的珠子进行分析, 并对所合成的图像进行解析, 计算出硅基板的杨氏模量。将基体的顶面与模数胞外基质蛋白耦合 (除了荧光珠), 使硅基板易于用于细胞电镀和随后的研究使用牵引力显微镜实验。使用硬质硅胶, 而不是培养皿, 作为软硅胶的基础, 使使用美国匹茨堡研究涉及外部拉伸。该协议的一个具体优点是, widefield 荧光显微镜在许多实验室中是常见的, 是本程序所需的主要设备。我们通过测量不同弹性模量的软硅基板的杨氏模量来证明该协议。
Introduction
软组织细胞位于微环境中, 其刚度在 kilopascal 范围为1, 与组织培养皿的硬度为几级以上。早期的细胞外基质蛋白涂层软基板的实验表明, 基底刚度影响细胞的移动以及坚持在2,3下的细胞外基质。事实上, 基底刚度从根本上影响细胞功能4 , 其方式类似于弥漫的生化信号。聚丙烯酰胺凝胶 (涂有细胞外基质蛋白) 是 (水渗透) 凝胶, 已广泛用作细胞培养基质的美国匹茨堡研究5。烷是最常见的有机硅 (聚硅氧烷), 广泛应用于兆帕斯卡硬度为微米级制造6的硬硅树脂。最近, 在生理上相关的 kilopascal 范围内有刚性的软硅基板被使用作为细胞培养基质为美国匹茨堡研究7,8。
采用了几种方法测量柔性基板的刚度, 包括原子力显微镜、拉伸、流变和压痕时全试样的宏观变形, 球面和球尖 microindentors 9..虽然每种技术都有自己的优缺点, 但用球体压痕是一种特别简单而又相当精确的方法, 只需要进入 widefield 荧光显微镜。在前工作3、9、10中, 用金属球体压痕测量水凝胶的刚度。早期的工作表明基底刚度对细胞运动的重要性, 利用这种方法来确定水凝胶基板刚度3。最近, 共焦显微术也被用于一个优雅的特征10。
在这里, 我们提出了一个逐步的协议, 以准备一个软的硅基板, 耦合荧光珠 (和细胞外基质蛋白, 如胶原 i) 只是到顶端表面, 成像一个缩进球和顶面使用阶段和荧光成像, 分别对图像进行分析, 计算出硅基板杨氏模量。这种方式制备的软硅基板可以方便地用于牵引力显微实验。使用硬硅树脂 (而不是培养皿) 作为软硅胶的基础也使美国匹茨堡研究使用外部拉伸。如有必要, 还指出了避免可能出现的并发症所需的实际考虑。
Protocol
Representative Results
Discussion
球形压痕法易于实现, 但要注意 indentor 的选择和软硅试样的厚度。用于计算杨氏模量的方程式在一组条件下有效11, 当硅胶样品的厚度 > 10% 的 indentor 半径和 < ~ 13 x indentor 半径时, 通常会满足这些要求。我们发现, 硅树脂厚度为 5-10x 的 indentor 半径是一个很好的选择, 其中试样厚度不太高 (即目标工作距离不成为限制), 计算刚度也不太敏感的硅胶厚度的精确值。球形 indentor 的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢玛格丽特卡洛斯·加德尔慷慨地允许使用流变仪。我们承认 NIH (1R15GM116082) 支持这项工作。
Materials
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
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