एक Widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग Mechanobiology अध्ययन के लिए नरम सिलिकॉन सब्सट्रेट की कठोरता माप
Summary
kilopascal में कठोरता के साथ सब्सट्रेट-रेंज शारीरिक रूप से प्रासंगिक सूक्ष्म पर्यावरण कठोरता के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं. सिर्फ एक widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, मुलायम सिलिकॉन जैल के युवा के मापांक एक उपयुक्त क्षेत्र के साथ एक इंडेंट का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है.
Abstract
मानव शरीर में कोमल ऊतकों आम तौर पर kilopascal (केपीए) रेंज में कठोरता है । तदनुसार, सिलिकॉन और hydrogel लचीला सब्सट्रेट एक भौतिक microenvironment कि आंशिक रूप से vivo स्थितियों में नकल में संवर्धन कोशिकाओं के लिए उपयोगी सब्सट्रेट होना सिद्ध किया गया है. यहां, हम आम तौर पर mechanobiology अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया आइसोट्रोपिक रैखिक लोचदार सब्सट्रेट के युवा की moduli निस्र्पक के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । प्रोटोकॉल एक पेट्री डिश या कड़ी सिलिकॉन पर एक नरम सिलिकॉन सब्सट्रेट तैयार करने के होते हैं, फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ सिलिकॉन सब्सट्रेट के शीर्ष सतह कोटिंग, एक मिलीमीटर पैमाने क्षेत्र का उपयोग कर शीर्ष सतह (गुरुत्वाकर्षण द्वारा) इंडेंट करने के लिए, इमेजिंग फ्लोरोसेंट एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर दांतेदार बना सिलिकॉन सतह पर मोती, और सिलिकॉन सब्सट्रेट के युवा के मापांक की गणना करने के लिए परिणामी छवियों का विश्लेषण. एक moduli extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ है सब्सट्रेट शीर्ष सतह युग्मन (फ्लोरोसेंट मोतियों के अलावा) सिलिकॉन सब्सट्रेट आसानी से सेल चढ़ाना और बाद में अध्ययन कर्षण बल माइक्रोस्कोपी प्रयोगों का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है । कड़ी सिलिकॉन का उपयोग, बजाय एक पेट्री डिश के नरम सिलिकॉन के आधार के रूप में, mechanobiology बाहरी खिंचाव को शामिल अध्ययन के उपयोग में सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल का एक विशिष्ट लाभ यह है कि एक widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, जो सामांयतः कई प्रयोगशालाओं में उपलब्ध है, प्रमुख इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक उपकरण है । हम विभिंन लोचदार moduli के नरम सिलिकॉन सब्सट्रेट के युवा मापांक को मापने के द्वारा इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन ।
Introduction
कोमल ऊतकों में कोशिकाओं को एक सूक्ष्म वातावरण में रहते है जिसकी कठोरता kilopascal रेंज1, ऊतक संस्कृति व्यंजन जिसका कठोरता परिमाण उच्च के कई आदेश है इसके विपरीत में है । extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन लेपित नरम सब्सट्रेट पर कोशिकाओं के साथ प्रारंभिक प्रयोगों से पता चला कि सब्सट्रेट कठोरता कैसे कोशिकाओं पर कदम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से2,3के नीचे extracellular मैट्रिक्स का पालन करने के लिए प्रभाव. वास्तव में, सब्सट्रेट कठोरता मौलिक एक व्यापक जैव रासायनिक संकेतों के समान तरीके से सेल4 समारोह को प्रभावित करता है । Polyacrylamide जैल (extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ लेपित) कर रहे है (water-permeating) hydrogels है कि बड़े पैमाने पर किया गया है सेल संस्कृति सब्सट्रेट के रूप में mechanobiology अध्ययन के लिए5। Polydimethylsiloxane (PDMS), सबसे आम सिलिकॉन (polysiloxane), व्यापक रूप से megapascal-माइक्रोन पैमाने पर निर्माण6के लिए सीमा कठोरता के साथ एक कड़ी सिलिकॉन के रूप में इस्तेमाल किया गया है । हाल ही में, अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक kilopascal रेंज में कठोरता के साथ नरम सिलिकॉन सब्सट्रेट mechanobiology अध्ययन के लिए सेल संस्कृति सब्सट्रेट के रूप में नियोजित किया गया है7,8.
कई तरीकों को लचीला सब्सट्रेट की कठोरता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है, परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी सहित, खींच पर पूरे नमूनों की macroscopic विकृति, rheology, और इंडेंटेशन क्षेत्रों का उपयोग और गोलाकार microindentors 9 इत्तला दे दी . जबकि प्रत्येक तकनीक अपने फायदे और नुकसान है, एक क्षेत्र के साथ इंडेंटेशन एक विशेष रूप से सरल अभी तक काफी सटीक तरीका है कि केवल एक widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के लिए उपयोग की आवश्यकता है । एक धातु क्षेत्र के साथ इंडेंटेशन से पहले काम3,9,10में hydrogels की कठोरता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है । जल्दी काम है कि सेल आंदोलन के लिए सब्सट्रेट कठोरता के महत्व का प्रदर्शन इस विधि hydrogel सब्सट्रेट कठोरता3निर्धारित करने के लिए उपयोग किया । हाल ही में, फोकल माइक्रोस्कोपी भी एक सुरुचिपूर्ण लक्षण वर्णन10के लिए इस्तेमाल किया गया है ।
यहां, हम एक नरम सिलिकॉन सब्सट्रेट तैयार करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल वर्तमान, (और एक extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन जैसे कोलेजन मैं) सिर्फ शीर्ष सतह के लिए, इमेजिंग एक क्षेत्र इंडेंट और शीर्ष चरण का उपयोग कर सतह और प्रतिदीप्ति इमेजिंग, क्रमशः, और अंत में छवियों का विश्लेषण करने के लिए सिलिकॉन सब्सट्रेट के युवा मापांक की गणना । नरम सिलिकॉन सब्सट्रेट इस तरह से तैयार किया जा सकता है आसानी से कर्षण बल माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया. (बजाय एक पेट्री डिश के) नरम सिलिकॉन के लिए आधार के रूप में कड़ी सिलिकॉन का उपयोग भी mechanobiology एक बाहरी खिंचाव का उपयोग कर अध्ययन में सक्षम बनाता है । जहां वारंट, व्यावहारिक संभव जटिलताओं से बचने के लिए आवश्यक विचार भी संकेत दिए हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
क्षेत्र इंडेंटेशन विधि को लागू करने के लिए आसान है, जबकि सावधान ध्यान फ्रॉम की पसंद और नरम सिलिकॉन नमूने की मोटाई के लिए भुगतान किया जाना चाहिए । युवा के मापांक की गणना करने के लिए उपयोग किया गया समीकरण<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उदारता से rheometer के उपयोग की अनुमति के लिए मार्गरेट Gardel धंयवाद । हम इस काम को सक्षम NIH (1R15GM116082) से समर्थन स्वीकार करते हैं ।
Materials
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
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