Stivhet måling av myk silikon underlag for Mechanobiology studier med Widefield fluorescens mikroskop
Summary
Underlag med stivhet i kilopascal-området er nyttig å studere svaret celleområde fysiologisk relevante mikro-miljø stivhet. Bruker bare widefield fluorescens mikroskop, kan den unge modulus myk silikon gelé bestemmes et innrykk med en egnet sfære.
Abstract
Myke vev i kroppen har vanligvis stivhet i fjellkjeden kilopascal (kPa). Følgelig, silikon og hydrogel fleksibel underlag er påvist for å være nyttig substrater for dyrking celler i en fysisk microenvironment som etterligner delvis i vivo forhold. Her presenterer vi en enkel protokoll for å karakterisere den unge moduli av isotropic lineære elastiske underlag brukes vanligvis for mechanobiology studier. Protokollen består av forbereder en myk silikon substrat på en Petriskål eller stiv silikon belegg overflaten av silikon underlaget med fluorescerende perler, bruker en millimeter skala kule rykke inn overflaten (av tyngdekraften), imaging den selvlysende fargen perler på innrykket silikon overflaten bruker fluorescens mikroskop, og analysere resulterende bildene til å beregne den unge modulus av silikon underlaget. Kopling underlagets overflaten med en moduli ekstracellulær matrix proteiner (i tillegg til fluorescerende perler) kan silikon underlaget kan lett brukes til celle plating og etterfølgende studier med trekkraft force mikroskopi eksperimenter. Bruk av stive silikon, i stedet for en Petriskål, som grunnlag for myk silikon, muliggjør bruk av mechanobiology studier som involverer eksterne strekningen. En bestemt fordel av denne protokollen er at en widefield fluorescens mikroskop, som er allment tilgjengelig i mange laboratorier, store utstyret som er nødvendig for denne prosedyren. Ved å måle den unge modulus av myk silikon underlag av ulike elastiske moduli viser vi denne protokollen.
Introduction
Celler i bløtvev ligge i en mikro-miljø som stivhet i kilopascal område1, i motsetning til vev kultur retter som stivhet er flere størrelsesordener høyere. Tidlige eksperimenter med celler i ekstracellulær matrix proteiner-belagt mykt underlag viste at substrat stivheten påvirker hvordan flytte på tillegg overholder den ekstracellulære matrisen under2,3. Faktisk påvirker substrat stivheten fundamentalt celle funksjon4 på samme måte som til gjennomgripende biokjemiske signaler. Polyakrylamid gels (belagt med ekstracellulær matrix proteiner) er (vann-gjennomsyre) hydrogels som er mye brukt som celle kultur underlag for mechanobiology studier5. Polydimethylsiloxane (PDMS), den vanligste silikon (polysiloxane), har vært mye brukt som en stiv silikon med megapascal rekkevidde stivhet i mikro-skala fabrikasjon6. Mer nylig myk silikon underlag med stivhet i området mer fysiologisk relevante kilopascal har vært ansatt som celle kultur substrater for mechanobiology studier7,8.
Flere metoder har blitt brukt til å måle stivhet av fleksible underlag, inkludert atomic force mikroskopi, makroskopisk deformasjon av hele prøver på stretching, Reologi og innrykk med kuler og sfærisk tippet microindentors9 . Mens hver teknikk har sine egne fordeler og ulemper, er innrykk med en kule en spesielt enkel, men ganske nøyaktig metode som bare krever tilgang til widefield fluorescens mikroskop. Innrykk med en metallisk kule har blitt brukt til å måle stivhet av hydrogels i tidligere arbeid3,9,10. Tidlig arbeid som vist betydningen av underlaget stivhet celle bevegelse utnyttet denne metoden for å bestemme hydrogel substrat stivhet3. Flere nylig, AC confocal mikroskopi er også brukt for en elegant karakterisering10.
Her presenterer vi en trinnvis protokoll for å forberede en myk silikon underlaget, kopling fluorescerende perler (og en ekstracellulær matrix proteiner som kollagen jeg) bare til toppen overflaten, tenkelig et innrykk sfære og topp overflate ved hjelp fase og fluorescens tenkelig, henholdsvis, og til slutt analysere bildene til å beregne den unge modulus av silikon underlaget. Myk silikon underlaget forberedt på denne måten kan lett brukes for trekkraft force mikroskopi eksperimenter. Bruk av stive silikon (i stedet for en Petriskål) som base for myk silikon kan også mechanobiology studier med en ekstern stretch. Hvor berettiget, angis også praktiske hensyn nødvendig for å unngå mulige komplikasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens metoden sfære innrykk er lett å implementere, må forsiktig oppmerksomhet betales til valg av indentor og tykkelsen på myk silikon prøven. Formelen brukes til å beregne den unge modulus er gyldig under en rekke forhold11og dette er vanligvis oppfylt når tykkelsen av silikon prøven er > 10% av indentor radius og < ~ 13 x indentor radius. Vi fant at silikon tykkelse på 5-10 x indentor radius var et godt valg, hvor eksempel tykkelsen ikke er for høyt (dvs.den objektive arbeidsa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Margaret Gardel for sjenerøst tillater bruk av rheometer. Vi anerkjenner støtte fra NIH (1R15GM116082) aktivert dette arbeidet.
Materials
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
- Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
- Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M., Cassimeris, L., Tran, P. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. , 133-146 (2010).
- Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
- Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).
- Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).
