Субстратов с жесткостью в диапазоне килопаскаль полезны для изучения реакции клеток физиологически соответствующей жесткости микро среды. Используя просто widefield флуоресцентным микроскопом, Юнга мягкие силиконовые гели могут быть определены с помощью отступов с подходящей сфере.
Мягких тканей в организме человека, как правило, имеют жесткость в диапазоне килопаскаль (kPa). Соответственно силикона и гидрогелевые гибких подложках было доказано быть полезным субстратов для культивирования клеток в физической микроокружения, который частично имитирует условия в естественных условиях . Здесь мы представляем простой протокол для характеризующие модули Юнга изотропной линейной эластичной субстратов, обычно используется для mechanobiology исследования. Протокол состоит из подготовки субстрата мягкого силикона на Петри блюдо или жесткой силиконовые, покрытие верхней поверхности субстрата силикона с бусами Флюоресцентная, с помощью миллиметровой шкалы сферы для отступа верхней поверхности (по тяжести), визуализации люминесцентные Бусы на поверхности с отступом силикона с помощью микроскопа флуоресценции и анализ результирующего изображения для вычисления Юнга силиконовые подложки. Муфта верхней поверхности субстрата с белков внеклеточного матрикса модулей (кроме флуоресцентный бусины) позволяет силиконовые подложки легко использоваться для ячейки покрытия и последующие исследования, с помощью экспериментов микроскопии силы тяги. Использование жесткой силикона, вместо Петри блюдо, как основа мягкого силикона, позволяет использовать mechanobiology исследований с участием внешних стрейч. Конкретные преимуществом этого протокола является widefield флуоресцентным микроскопом, которая обычно доступна во многих лабораториях, основного оборудования, необходимого для выполнения этой процедуры. Мы демонстрируем это протокол путем измерения Юнга мягкого силикона субстратов различных упругих модулей.
Клетки в мягких тканях находятся в микро среды, чьи жесткость находится в килопаскаль диапазона1, в отличие от культуры ткани блюда которого жесткость несколько порядков выше. Первые эксперименты с клетки на внеклеточная матрица белка покрытием мягкие субстраты показал, что жесткость субстрат влияет как клетки двигаться дальше, а также придерживаться внеклеточного матрикса под2,3. В самом деле субстрат жесткость принципиально влияет на функции клеток4 в аналогии с широко распространенной биохимических сигналы. Полиакриламидных гелей (покрытые белков внеклеточного матрикса) (вода проникая) гидрогели, широко использовались как клетки культуры субстратов для mechanobiology исследований5. Полидиметилсилоксан (PDMS), наиболее распространенных силиконовые (полисилоксан), широко используется как жесткая силикона с мегапаскаль диапазона жесткости для изготовления микрон шкала6. Совсем недавно, мягкого силикона, который субстратов с жесткостью в диапазоне более физиологически соответствующих килопаскаль были заняты в качестве подложки культуры клеток для mechanobiology исследования,78.
Некоторые методы были использованы для измерения жесткости гибких подложках, включая атомно-силовой микроскопии, макроскопической деформации всей образцов на растяжение, реологии и отступы с помощью сферы и сферически наконечником microindentors9 . Хотя каждая техника имеет свои преимущества и недостатки, отступы со сферой является особенно простой, но довольно точный метод, который требует только доступ к widefield флуоресцентным микроскопом. Отступы с металлический шар был использован для измерения жесткости гидрогели в предыдущие работы3,9,10. Ранние работы, которая продемонстрировала важность субстрат жесткость клеточного движения использовали этот метод для определения гидрогеля субстрата жесткость3. Совсем недавно конфокальная микроскопия используется также для элегантной характеристика10.
Здесь, мы представляем пошаговые протокол для подготовки субстрата мягкого силикона, муфты флуоресцентные бусины (и белков внеклеточного матрикса, таких как коллаген я) только к верхней поверхности, воображения отступов сферы и верхней поверхности с использованием фазы и флуоресценции изображений, соответственно и, наконец, анализ изображений для вычисления Юнга силиконовые подложки. Мягкие силиконовые подложки, подготовленных таким образом легко может использоваться для тяговой силы микроскопии экспериментов. Использование жесткой силиконовые (вместо чашку Петри) как база для мягкого силикона также позволяет mechanobiology исследования с использованием внешних стрейч. Где это уместно, также указаны практические соображения, необходимые для предотвращения возможных осложнений.
В то время как сфера отступ метод прост в реализации, особое внимание должно уделяться выбор indentor и толщина мягкого силикона образца. Уравнение используется для вычисления Юнга действует под набор условий11и обычно они удовлетворены когда толщина образца силикона-> 10% от ра…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Гардель Маргарет за щедро позволяет использовать Реометр. Мы признаем поддержку от НИЗ (1R15GM116082), что позволило этой работы.
CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |