Explorar el potencial de la hoja de células madre mesenquimales en el desarrollo de Carcinoma Hepatocelular en Vivo
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para desarrollar un modelo de cáncer en vivo utilizando la tecnología de hoja de la célula. Tal modelo podría ser muy útil para la evaluación de la terapéutica contra el cáncer.
Abstract
Un en vivo modelo animal que simula cáncer podría tener diversas aplicaciones que ofrecen información clínica importante. Las técnicas actualmente utilizadas para el desarrollo de modelos de cáncer en vivo tienen considerables limitaciones. Por lo tanto, en este estudio, nuestro objetivo es implementar la tecnología de hoja de la célula para desarrollar un modelo de cáncer en vivo . Carcinoma hepatocelular (HCC) se desarrolló con éxito en ratas desnudas utilizando hojas de célula creadas a partir de células de línea de células HCC. Las hojas de la célula de cáncer se generan a través de la adhesión intracelular y la formación de una estructura estratificada, controlada por la matriz extracelular. Esto permite que el trasplante de la hoja HCC en el hígado y la creación de un modelo animal con tumores dentro de un mes. Además, se investiga el papel de las células madre mesenquimales (MSC) en el desarrollo de este modelo de cáncer. Además de la hoja de línea de células HCC, se crean otro hojas de dos células: una hoja de células HCC y médula MSCs (BMMSCs) y una hoja de células HCC y cordón umbilical MSCs (UCMSCs). Las hojas que tienen una combinación de células HCC y MSCs también son capaces de producir un animal con tumores. Sin embargo, la adición de MSCs reduce el tamaño del tumor formado, y este efecto adverso en el desarrollo del tumor varía dependiendo de la fuente de las MSCs usado. Esto indica que se podría utilizar una hoja de la célula de ciertos subtipos MSC en control y gestión de tumor.
Introduction
HCC es un cáncer primario del hígado que está significativamente asociado con un pronóstico pobre. Anualmente, casi medio millón se diagnostican nuevos pacientes con HCC, que representan el 85% de pacientes de cáncer de hígado en todo el mundo1. Hepatocarcinogenesis no es una enfermedad de forma individual; por el contrario, es una colección de enfermedades que tienen diferentes características histopatológicas y la variabilidad genética y genómica, además variados resultados pronóstico1. Por lo tanto, los principales retos en el desarrollo de una estrategia terapéutica efectiva para el CHC son el conocimiento limitado de la biología HCC y la falta de un adecuado modelo experimental animal que puede ayudar a entender esta compleja enfermedad. Un en vivo modelo animal que simula cáncer humano es necesario para la selección de genes candidatos y la identificación de marcadores pronóstico/predicción implicados en la inducción de cáncer, así como para investigar los diferentes factores que pueden afectar las respuestas de cáncer a los agentes terapéuticos.
Estudios de cáncer in vitro están todavía asociados con limitaciones importantes. Esto es debido a que las células cancerosas pierden muchas de sus características en vivo cuando se mantienen en cultivo. Los cambios que se producen a las células en vitro resultado de la ausencia de la fisiología del tejido todo en un entorno de ex vivo . Interacción de célula a célula de cáncer (stromal, inmune, vasculatura, epitelial, etc.) dentro del microambiente del tumor refleja grandemente en cáncer celular características2. El microambiente tumoral podría alterar la expresión de gene de la proteína de la célula de cáncer y características fenotípicas, además de angiogenetic y potencial metastásico. El sistema de cultivo bidimensionales (2D) en vitro también carece de una matriz de tejido adecuado, que es necesaria regular la progresión del tumor. Así, debido a estas limitaciones, en vivo modelos siempre deben ser utilizados para apoyar los resultados preliminares de los modelos en vitro . En este estudio, utilizamos tecnología de hoja de la célula para desarrollar un en vivo modelo animal que aclara el proceso biológico subyacente HCC.
Hace más de una década, laboratorio de Okano estableció un nuevo método de la ingeniería de tejido partiendo de células hoja tecnología3. Esta técnica utiliza un plástico termo-sensible de la cultura para permitir adherencia/desprendimiento celular reversible mediante el control de la hidrofobicidad superficial. Este método permite una extracción suave de células cultivadas en un formato (3D) tridimensional intacta (hoja i.e.,cell), con una cuidada matriz extracelular (ECM) y las interacciones célula a célula. La técnica de la hoja de la célula requiere cubrir el primero de los platos de la cultura con un poly(N-isopropylacrylamide) de polímero sensible a la temperatura (PIPA soy), que está comercialmente disponible y listo para usar. A una temperatura inferior a 20 ° C, PIPA soy polímeros se convierten hidratados y se disuelven en soluciones acuosas, mientras que, en una temperatura más alta (37 ° C), los polímeros se deshidrate y transforman en un precipitado turbio. El polímero contiene amida hidrofílico cadenas y las cadenas laterales hidrofóbicas (grupos isopropilo). A altas temperaturas, el movimiento browniano de las moléculas de agua se intensifica, mientras que a baja temperatura, las moléculas del agua que rodea los grupos isopropilo de la ruptura de la estructura hidratada y los grupos de isopropilo hidrofóbica agregadas debido a las interacciones hidrofóbicas. Por lo tanto, toda la cadena del polímero agregados y precipitados de4.
En el estudio presentado, esta técnica se emplea para desarrollar un modelo animal de HCC con tres hojas de células diferentes. La primera hoja empleada consiste en células HCC célula línea solamente, mientras que las otras dos hojas consisten en una combinación de células de línea de células HCC y MSCs de dos fuentes diferentes: MSCs (BMMSCs) de la médula ósea y cordón umbilical MSCs (UCMSCs). MSCs son células estromales no-hematopoyéticas que son capaces de distinguir los derivados intocell de la estirpe mesenquimal, incluyendo adipocitos, osteocitos, condrocitos y miocitos5. La razón por la que emplean estas células al crear la hoja de la célula de cáncer es la información inconsistente sobre el efecto de MSCs en cánceres. Se ha sugerido que MSCs pueden tener dos fenotipos distintos: “MSC1”, un fenotipo proinflamatorias y “MSC2”, un fenotipo inmunosupresores6. MSCs expresan receptores toll-like (TLRs). Cebado de TLR4 de MSCs aumenta su secreción de factores proinflamatorios, mientras que TLR3 cebado aumenta su secreción de factores inmunosupresores6. Un estudio en vitro de estos dos fenotipos informó que un cocultivo de MSC1 con líneas celulares de cáncer había atenuado crecimiento celular del cáncer, mientras que cultura Co MSC2 tenía el efecto opuesto7. Esto implica que MSCs pueden ser cáncer Pro o contra el cáncer, según su fenotipo. Así, además de desarrollar el modelo animal de HCC, utilizando la tecnología de hoja celular, queremos explorar el efecto de los trasplantes MSC en el desarrollo del tumor, y si estas células se aumentar o reducir el desarrollo de este modelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una gran cantidad de investigación se dedica a desarrollar un adecuado en vivo preclínicos modelo animal que se asemeja a los cánceres humanos. Actualmente, los principales enfoques utilizados para crear modelos animales de cáncer involucran la ingeniería genética y celular trasplante11. Modelos animales modificados genéticamente son buenas herramientas para la identificación y validación de genes diana, así como la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes la toxic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean dar las gracias al personal de la Cirugía Experimental y laboratorio Animal de la Facultad de medicina de la Universidad Rey Saud, por su cooperación y apoyo, especialmente Hussain Almukhayzim y Hisham Aloudah. Los autores también desean reconocer el equipo de medios de comunicación de Rey Saud bin Abdul-Aziz University para preparar el visual material especialmente Muath bin Ghannam y Abdulwahab Alsulami.
Materials
| Reagents | |||
| FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
| Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
| Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
| Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
| human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
| Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
| Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
| Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
| Disposables: | |||
| 15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
| 3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
| 100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
| Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
| Equipment | |||
| Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Biological safety cabinet | Any brand | ||
| Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Sterile surgical tools and nude rats: | |||
| Forceps | |||
| Scissors | |||
| scalpel | |||
| Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
| 1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Nude rats | Charles river | ||
References
- Marra, M., et al. Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview. Journal of Translational Medicine. 9, 171 (2011).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Kushida, A., et al. Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide). Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), e10088 (2010).
- Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis. PLoS One. 7 (9), e45590 (2012).
- Curtin, L. I., et al. Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats. Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).
- . Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats – ULAM Guidelines and SOPs – Michigan Medicine Confluence Available from: https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats (2017)
- Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models. PLoS One. 12 (8), e0184004 (2017).
- Russo, J., Russo, I. H. Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Current Drug Metabolism. 9 (5), 419-438 (2008).
- Driscoll, J. S. The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute. Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).
- Suzuki, R., Aruga, A., Kobayashi, H., Yamato, M., Yamamoto, M. Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering. Anticancer Research. 34 (9), 4747-4754 (2014).
- Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).
- Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. Cell sheet transplantation for heart tissue repair. Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).
- Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology. International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent?. Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).
