استكشاف إمكانات ورقة الخلايا الجذعية الوسيطة على تطوير سرطانه الخلية الكبدية في فيفو
Summary
نقدم هنا، بروتوكول لتطوير في فيفو سرطان نموذج باستخدام تكنولوجيا خلايا ورقة. نموذج من هذا القبيل يمكن أن تكون مفيدة جداً لتقييم علاجات السرطان.
Abstract
يمكن أن يكون في فيفو حيوان نموذجا يحاكي سرطان البشرية مختلف التطبيقات التي تقدم المعلومات السريرية الهامة. التقنيات المستخدمة حاليا لتطوير نماذج السرطان في فيفو على قيود كبيرة. ولذلك، في هذه الدراسة، ونحن نهدف إلى تنفيذ تكنولوجيا خلايا الورقة وضع نموذج سرطان في فيفو . سرطانه الخلية الكبدية (HCC) هو وضع بنجاح في الفئران عارية استخدام أوراق الخلية التي تم إنشاؤها من العقود الخلية خط الخلايا. الأوراق خلايا السرطان التي تتولد عن طريق الالتصاق داخل الخلايا وتشكيل بنية طبقية، يسيطر عليها المصفوفة خارج الخلية. وهذا يسمح لزرع ورقة HCC في الكبد وإنشاء نموذج الحيوانات الحاملة لاستئصال ورم في غضون شهر. وباﻹضافة إلى ذلك، يجري التحقيق في دور الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) في وضع هذا النموذج السرطان. تم إنشاؤها بالإضافة إلى خلية ورقة العقود، وخط آخر خلية اثنين أوراق: ورقة من الخلايا العقود ونخاع العظم MSCs (BMMSCs) وورقة من الخلايا العقود والحبل السري MSCs (أوكمسكس). الأوراق التي لديها مزيج من الخلايا العقود و MSCs أيضا قادرة على إنتاج من الحيوانات الحاملة للورم. ومع ذلك، إضافة MSCs يقلل من حجم الورم المشكلة، وهذا أثر سلبي على التنمية الورم يختلف حسب المصدر MSCs المستخدمة. وهذا يشير إلى أنه من الممكن استخدام ورقة خلية المصنوعة من بعض أنواع المخططات الثانوية ماجستير في إدارة الورم والتحكم.
Introduction
العقود هي سرطان الكبد المرتبط إلى حد كبير سوء تشخيص الأولية. سنوياً، ما يقرب من نصف مليون يتم تشخيص المرضى الجدد مع العقود، الذين يمثلون 85% من مرضى سرطان الكبد في جميع أنحاء العالم1. هيباتوكارسينوجينيسيس ليس مرضاً نموذج واحد؛ بدلاً من ذلك، هو عبارة عن مجموعة من الأمراض التي لها ميزات نسيجية مختلفة والتغيرات الوراثية والجينوم، إضافة إلى تباين نتائج تشخيصية1. ولذلك، تتمثل التحديات الرئيسية في وضع استراتيجية علاجية فعالة للعقود هي المعرفة المحدودة للبيولوجيا العقود وعدم وجود نموذج مناسب الحيوانات التجريبية التي يمكن أن تساعد على فهم هذا المرض معقدة. في فيفو حيوان نموذجا يحاكي سرطان البشرية أمر ضروري لتحديد الجينات المرشحة، وتحديد علامات التنبؤات/التنبؤية المتورطين في أحداث السرطان، وكذلك للتحقيق في العوامل المختلفة التي قد تؤثر على استجابات السرطان إلى العوامل العلاجية.
لا يزال في المختبر دراسات السرطان المرتبطة بالقيود الرئيسية. وهذا يرجع إلى أن الخلايا السرطانية تفقد العديد من السمات في فيفو عندما يحتفظ في الثقافة. التغييرات التي تحدث للخلايا في المختبر نتيجة من غياب فسيولوجيا الأنسجة كلها في أجواء السابقين فيفو . سرطان خلية إلى التفاعل (stromal، ومحصنة، المفرج، الظهارية، إلخ) داخل ورم المكروية يعكس إلى حد كبير في سرطان الخلية الخصائص2. يمكن أن يغير وورم المكروية سرطان الخلية التعبير الجيني/البروتين وخواص، بالإضافة إلى أنجيوجينيتيك وإمكانات المنتشر. كما أن النظام الثقافة (2-د) ثنائي الأبعاد في المختبر يفتقر إلى مصفوفة أنسجة مناسبة، هو أمر ضروري لتنظيم تطور الورم. وهكذا، بسبب هذه القيود، في فيفو نماذج ينبغي دائماً تستخدم في دعم النتائج الأولية لنماذج في المختبر . في هذه الدراسة، نستخدم خلية ورقة تقنية لتطوير في فيفو حيوان نموذج الذي يوضح العملية البيولوجية الكاملة التي تقوم عليها العقود.
أكثر من عقد من الزمان، إنشاء مختبر اوكانو في طريقة جديدة لهندسة الأنسجة استناداً إلى خلية ورقة تقنية3. ويستخدم هذا الأسلوب من بلاستيك ثقافة حرارية مراعية للسماح الخلية عكسها الالتصاق/مفرزة من السيطرة على hydrophobicity السطحية. يسمح هذا الأسلوب حصاد رقيقة من الخلايا المستزرعة في شكل (ثلاثي الأبعاد) ثلاثية الأبعاد سليمة (صحيفة i.e.,cell)، مع مصفوفة خارج الخلية جيدا (ECM) والتفاعلات خلية بخلية. يتطلب الأسلوب خلية ورقة precoating أطباق الثقافة مع poly(N-isopropylacrylamide) بوليمر مراعية لدرجة حرارة (PIPA أنا)، مما متاح تجارياً وجاهزة للاستخدام. عند درجة حرارة أقل من 20 درجة مئوية، البوليمرات “وضوحها وأنا” أصبحت رطبة وتذوب في المحاليل، حيث أنه في درجة حرارة أعلى (37 درجة مئوية)، البوليمرات تصبح المجففة وتتحول ترسبات عكر. البوليمر تحتوي على سلاسل أميد ماء وسلاسل الجانب مسعور (مجموعات الأيزوبروبيل). في درجات حرارة عالية، هو تكثيف الحركة البراونية من جزيئات الماء، بينما عند درجة حرارة منخفضة، تجميع جزيئات المياه المحيطة بمجموعات الأيزوبروبيل انهيار هيكل رطب ومجموعات الأيزوبروبيل مسعور بسبب التفاعلات مسعور. ولذلك، السلسلة بأكملها من البوليمر المجاميع، ورواسب4.
في الدراسة المقدمة، ويستخدم هذا الأسلوب وضع نموذج حيوان العقود باستخدام ثلاث خلايا مختلفة أوراق. يتكون الورقة الأولى استخدمت العقود الخلية خط الخلايا فقط، بينما ورقتين الأخرى تتكون من مجموعة من العقود الخلية خط الخلايا و MSCs من مصدرين مختلفين: MSCs (BMMSCs) من نخاع العظام والحبل السري MSCs (أوكمسكس). MSCs الخلايا اللحمية غير-المكونة للدم التي قادرة على التفريق بين المشتقات إينتوسيل من سلالة الوسيطة، بما في ذلك adipocytes، أوستيوسيتيس، تشوندروسيتيس، وميوسيتيس5. نحن نوظف هذه الخلايا عند إنشاء ورقة خلية السرطان السبب الإبلاغ غير متناسقة على أثر MSCs على السرطان. قد اقترح أن MSCs يمكن أن تعمل منفصلة اثنين: “MSC1″، النمط الظاهري proinflammatory، و “MSC2″، النمط الظاهري كآبته6. MSCs عن حصيلة تشبه المستقبلات (TLRs). فتيلة TLR4 من MSCs يزيد على إفراز عوامل proinflammatory، بينما يزيد فتيلة TLR3 على إفراز العوامل المثبطة للمناعة6. وأفادت دراسة في المختبر من هذه تعمل اثنين أن ثقافة التعاون MSC1 مع خطوط خلايا السرطان يخفف نمو خلايا السرطان، بينما الثقافة المشارك MSC2 كان الأثر المعاكس7. وهذا تورط أن MSCs يمكن أن تكون مؤيدة السرطان أو السرطان، اعتماداً على النمط الظاهري. وهكذا، بالإضافة إلى تطوير النموذج الحيواني العقود باستخدام تكنولوجيا خلايا ورقة، أننا نريد لاستكشاف أثر زرع ماجستير في التنمية الورم، وعما إذا كان سيتم تعزيز استخدام هذه الخلايا أو الحد من تطوير هذا النموذج.
Protocol
Representative Results
Discussion
كمية واسعة من البحوث مكرس لتطوير كافية في فيفو الإكلينيكية حيوان نموذجا مشابهاً للسرطانات البشرية. في الوقت الراهن، تشمل النهج الرئيسية المستخدمة لإنشاء نماذج حيوانية سرطان الهندسة الوراثية وخلية زرع11. النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا أدوات جيدة لتحديد الهوية والتحق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر موظفي الجراحة التجريبية ومختبر الحيوان في كلية الطب، جامعة الملك سعود، على التعاون والدعم، خصوصا حسين المخيزيم وهشام العودة. الكتاب تود أيضا أن نعترف بفريق وسائط الإعلام في جامعة الملك سعود بن عبد العزيز لإعداد البصرية المادية لا سيما معاذ بن غنام وعبد الوهاب السلمي.
Materials
| Reagents | |||
| FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
| Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
| Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
| Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
| human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
| Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
| Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
| Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
| Disposables: | |||
| 15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
| 3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
| 100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
| Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
| Equipment | |||
| Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Biological safety cabinet | Any brand | ||
| Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Sterile surgical tools and nude rats: | |||
| Forceps | |||
| Scissors | |||
| scalpel | |||
| Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
| 1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Nude rats | Charles river | ||
References
- Marra, M., et al. Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview. Journal of Translational Medicine. 9, 171 (2011).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Kushida, A., et al. Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide). Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), e10088 (2010).
- Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis. PLoS One. 7 (9), e45590 (2012).
- Curtin, L. I., et al. Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats. Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).
- . Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats – ULAM Guidelines and SOPs – Michigan Medicine Confluence Available from: https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats (2017)
- Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models. PLoS One. 12 (8), e0184004 (2017).
- Russo, J., Russo, I. H. Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Current Drug Metabolism. 9 (5), 419-438 (2008).
- Driscoll, J. S. The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute. Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).
- Suzuki, R., Aruga, A., Kobayashi, H., Yamato, M., Yamamoto, M. Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering. Anticancer Research. 34 (9), 4747-4754 (2014).
- Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).
- Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. Cell sheet transplantation for heart tissue repair. Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).
- Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology. International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent?. Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).
