Verkennen van de mogelijkheden van mesenchymale stamcellen blad over de ontwikkeling van hepatocellulaire Carcinoma In Vivo
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling van een in vivo kanker model met behulp van blad celtechnologie. Een dergelijk model zou zeer nuttig zijn voor de evaluatie van antikanker therapeutics.
Abstract
Een in vivo dierlijk model dat menselijke kanker nabootst kon hebben verschillende toepassingen die belangrijke klinische informatie leveren. De momenteel gebruikte technieken voor de ontwikkeling van in vivo kanker modellen hebben aanzienlijke beperkingen. Daarom willen we in deze studie, cel blad technologie voor de ontwikkeling van een in vivo kanker model implementeren. Hepatocellulaire carcinoom (HCC) is met succes ontwikkeld bij naakte ratten met behulp van cel sheets gemaakt van HCC cel lijn cellen. De bladen van de cel kanker worden gegenereerd door intracellulaire hechting en de vorming van een gestratificeerde structuur, gecontroleerd door de extracellulaire matrix. Dit zorgt voor de HCC blad transplantatie in de lever en de oprichting van een dierlijk model van tumor-dragende binnen een maand. Daarnaast is de rol van mesenchymale stamcellen (MSC) in de ontwikkeling van deze kanker-model onderzocht. Naast de cellaag lijn HCC, een andere cel van de twee bladen zijn gemaakt: een vel van HCC cellen, beenmerg MSCs (BMMSCs) en een blad van HCC cellen en navelstreng MSCs (UCMSCs). Bladen die een combinatie van zowel HCC cellen en MSCs hebben zijn ook geschikt voor het produceren van een tumor-dragende dieren. Echter, de toevoeging van MSCs vermindert de grootte van de gevormde tumor en dit negatieve effect op de ontwikkeling van tumor varieert afhankelijk van de gebruikte MSCs bron. Dit geeft aan dat een cellaag gemaakt van bepaalde MSC-subtypen kan worden gebruikt in de tumor beheers- en controlesystemen.
Introduction
HCC is een primaire kanker van de lever die wordt sterk geassocieerd met een slechte prognose. Jaarlijks, bijna een half miljoen nieuwe patiënten zijn gediagnosticeerd met HCC, die 85% van lever kanker patiënten wereldwijd1vertegenwoordigen. Hepatocarcinogenesis is geen enkele vorm ziekte; het is veeleer een verzameling van ziekten die hebben verschillende histopathologische kenmerken en genetische en genomische variabiliteit, in aanvulling op gevarieerd prognostische resultaten1. Daarom zijn de belangrijkste uitdagingen bij de ontwikkeling van een effectieve therapeutische strategie voor HCC de beperkte kennis van HCC biologie en het gebrek aan een geschikte experimentele diermodel die kan helpen bij het begrijpen van deze ingewikkelde ziekte. Een in vivo dierlijk model dat menselijke kanker nabootst is nodig voor de selectie van kandidaat-genen en identificeren van prognostic/voorspellende markers betrokken in de inductie van kanker, maar ook voor het onderzoeken van de verschillende factoren die invloed kunnen hebben op kanker reacties aan therapeutische middelen.
In vitro studies van kanker zijn nog steeds geassocieerd met grote beperkingen. Dit is vanwege het feit dat kankercellen veel van hun functies in vivo verliezen als in cultuur gehandhaafd. De veranderingen die aan cellen in vitro resultaat van de afwezigheid van de Fysiologie van de hele weefsel in een ex vivo -instelling optreden. Kanker cel-naar-cel interactie (stromale, immuun, therapieën, epitheliale, enz.) binnen de tumor communicatie weerspiegelt sterk op kanker cel kenmerken2. De communicatie van de tumor kan kanker cel gen/eiwit expressie en fenotypische kenmerken, naast angiogenetic en gemetastaseerde potentieel wijzigen. Het tweedimensionale (2D) in vitro cultuur systeem ontbreekt ook een matrix geschikt weefsel, hetgeen noodzakelijk is voor het reguleren van de progressie van de tumor. Dus, als gevolg van deze beperkingen, in vivo modellen moeten altijd worden benut ter ondersteuning van de voorlopige bevindingen van in vitro modellen. In deze studie gebruiken we celtechnologie blad te ontwikkelen van een in vivo dierlijk model dat verklaart het volledige biologische proces ten grondslag liggen aan de HCC.
Meer dan een decennium geleden, Okano van laboratorium gevestigd een nieuwe methode van weefselengineering gebaseerd op cel blad technologie3. Deze techniek maakt gebruik van een plastic thermo-responsieve cultuur zodat omkeerbare cel adhesie/detachement door het beheersen van de oppervlakte hydrophobicity. Met deze methode kunt een zachte oogsten van gekweekte cellen in een intact driedimensionale (3-D) formaat (i.e.,cell blad), met een goed onderhouden extracellulaire matrix (ECM) en cel-naar-cel interacties. De cel blad techniek vereist de precoating van cultuur gerechten met een poly(N-isopropylacrylamide) van de temperatuur-responsieve polymeer (PIPA ben), dat is commercieel beschikbaar en klaar voor gebruik. Bij een temperatuur lager dan 20 ° C, PIPA ben polymeren worden gehydrateerd en ontbinden in waterige oplossingen, overwegende dat bij een hogere temperatuur (37 ° C), de polymeren gedroogd worden en tot een troebel neerslag omvormen. Het polymeer bevat hydrofiele amide kettingen en hydrofobe zijketens (isopropyl groepen). Bij hoge temperaturen, wordt de Brownse beweging van de watermoleculen versterkt, dat bij een lage temperatuur, de moleculen van het water rondom de isopropyl-groepen van de verdeling gehydrateerd structuur en de groepen van hydrofobe isopropyl statistische vanwege de hydrofobe interacties. Daarom is de gehele keten van het polymeer aggregaten en precipitaten4.
In de gepresenteerde studie, is deze techniek ingezet om te ontwikkelen een HCC dierlijk model met behulp van drie verschillende cel sheets. Het eerste blad dienst bestaat uit HCC cel lijn cellen alleen, terwijl de andere twee platen bestaan uit een combinatie van HCC cel lijn cellen en MSCs uit twee verschillende bronnen: beenmerg MSCs (BMMSCs) en de navelstreng MSCs (UCMSCs). MSCs zijn niet-hematopoietische stromale cellen die kunnen differentiëren intocell derivaten van de mesenchymale afkomst, met inbegrip van adipocytes, osteocytes, chondrocyten en myocytes5. De reden dat we deze cellen in dienst bij het maken van de cellaag van kanker is de inconsistente rapportage over het effect van MSCs op kanker. Er is gesuggereerd dat MSCs kunnen het hebben van twee verschillende fenotypes: “MSC1”, een proinflammatoire fenotype, en “MSC2”, een immunosuppressieve fenotype6. MSCs express toll-like receptoren (TLRs). TLR4 priming van MSCs verhoogt de secretie van proinflammatoire factoren, terwijl TLR3 priming de secretie van immunosuppressieve factoren6 verhoogt. Een in vitro studie van deze twee fenotypes gemeld dat een gezamenlijke cultuur van MSC1 met kanker cellijnen kanker-celgroei, verzwakt terwijl MSC2 co cultuur had het tegenovergestelde effect-7. Dit impliceert dat MSCs Pro-kanker of AntiKanker, afhankelijk van hun fenotype kunnen. Dus, naast de ontwikkeling van de HCC diermodel met behulp van blad celtechnologie, we willen verkennen van het effect van MSC transplantaties ontwikkelingssamenwerking van de tumor, en met behulp van deze cellen zal verbeteren of verminderen van de ontwikkeling van dit model.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een uitgebreide hoeveelheid onderzoek is gewijd aan de ontwikkeling van een adequaat in vivo preklinische diermodel strekking menselijke kankers. Op dit moment betrekken de belangrijkste benaderingen gebruikt voor het maken van kanker diermodellen genetische manipulatie en cel transplantatie11. Genetisch gemodificeerde dierlijke modellen zijn goede instrumenten voor de identificatie en validatie van de doelgenen, evenals het begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank de medewerkers van de experimentele heelkunde en dier laboratorium aan het College of Medicine, Koning Saud Universiteit, voor hun samenwerking en steun, vooral Hussain Almukhayzim en Hisham Aloudah. De auteurs wil ook erkennen het mediateam aan Koning Saud bin Abdul-Aziz University voor het voorbereiden van het visuele materiaal, vooral Muath bin Ghannam en Abdulwahab Alsulami.
Materials
| Reagents | |||
| FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
| Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
| Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
| Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
| human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
| Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
| Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
| Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
| Disposables: | |||
| 15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
| 3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
| 100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
| Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
| Equipment | |||
| Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Biological safety cabinet | Any brand | ||
| Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Sterile surgical tools and nude rats: | |||
| Forceps | |||
| Scissors | |||
| scalpel | |||
| Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
| 1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Nude rats | Charles river | ||
References
- Marra, M., et al. Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview. Journal of Translational Medicine. 9, 171 (2011).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Kushida, A., et al. Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide). Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), e10088 (2010).
- Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis. PLoS One. 7 (9), e45590 (2012).
- Curtin, L. I., et al. Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats. Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).
- . Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats – ULAM Guidelines and SOPs – Michigan Medicine Confluence Available from: https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats (2017)
- Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models. PLoS One. 12 (8), e0184004 (2017).
- Russo, J., Russo, I. H. Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Current Drug Metabolism. 9 (5), 419-438 (2008).
- Driscoll, J. S. The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute. Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).
- Suzuki, R., Aruga, A., Kobayashi, H., Yamato, M., Yamamoto, M. Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering. Anticancer Research. 34 (9), 4747-4754 (2014).
- Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).
- Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. Cell sheet transplantation for heart tissue repair. Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).
- Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology. International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent?. Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).
