Explorer le potentiel des cellules souches mésenchymateuses feuille sur le développement du carcinome hépatocellulaire In Vivo

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à développer un modèle cancer in vivo à l’aide de la technologie des cellules feuille. Un tel modèle pourrait être très utile pour l’évaluation des traitements anticancéreux.

Abstract

Un modèle in vivo animal qui imite le cancer chez l’homme pourrait avoir plusieurs applications qui fournissent des informations cliniques significatifs. Les techniques actuellement utilisées pour le développement de modèles in vivo de cancer ont des limites considérables. Par conséquent, dans cette étude, nous visons à mettre en œuvre de la technologie des piles à feuille pour développer un modèle de cancer in vivo . Carcinome hépatocellulaire (CHC) est développé avec succès chez le rat nude en utilisant des feuilles de cellule créées à partir des cellules de la lignée cellulaire HCC. Les feuilles de cellules de cancer sont générés par adhérence intracellulaire et la formation d’une structure stratifiée, contrôlée par la matrice extracellulaire. Cela permet la transplantation de feuille HCC dans le foie et la création d’un modèle animal de tumeur-roulement, moins d’un mois. En outre, on étudie le rôle des cellules souches mésenchymateuses (CSM) dans le développement de ce modèle de cancer. En plus de la plaque de ligne de cellules HCC, un autre des feuilles de deux cellules sont créées : une feuille de cellules HCC et moelle osseuse MSCs (BMMSCs) et une feuille de cellules HCC et cordon ombilical MSCs (UCMSCs). Les feuilles qui ont une combinaison des cellules de la HCC et MSCs sont aussi capables de produire un animal avec tumeur. Toutefois, l’ajout de MSCs réduit la taille de la tumeur formée, et cet effet néfaste sur le développement de tumeurs varie selon source des MSCs utilisé. Cela indique qu’il pourrait utiliser une feuille de cellules de certains sous-types MSC dans le contrôle et la gestion de la tumeur.

Introduction

HCC est un cancer primitif du foie qui est significativement associé à un mauvais pronostic. Chaque année, presque un demi-million de nouveaux patients sont diagnostiqués avec HCC, qui représentent 85 % des patients de cancer du foie dans le monde¹. Hepatocarcinogenesis n’est pas une maladie unique-forme ; C’est plutôt un ensemble de maladies qui ont différentes caractéristiques histopathologiques et variabilité génétique et génomique, outre varié résultats pronostiques¹. Par conséquent, les principaux défis à l’élaboration d’une stratégie thérapeutique efficace pour HCC sont la connaissance limitée de la biologie de la HCC et l’absence d’un modèle animal expérimental adapté qui peut aider à comprendre cette maladie complexe. Un modèle in vivo animal qui imite le cancer chez l’homme est nécessaire pour la sélection des gènes candidats et d’identifier des marqueurs pronostiques/prédictifs impliqués dans l’induction du cancer, ainsi que pour l’étude des différents facteurs qui peuvent influer sur les réponses du cancer d’agents thérapeutiques.

Des études in vitro du cancer sont toujours associées à des limites importantes. Cela est dû au fait que les cellules cancéreuses perdent beaucoup de leurs caractéristiques en vivo lorsque maintenu en culture. Les changements qui se produisent à des cellules in vitro résultat de l’absence de la physiologie du tissu entier dans un cadre ex vivo . Interaction de cellule-cellule de cancer (stromal, immunitaire, système vasculaire, épithélial, etc.) dans le microenvironnement tumoral reflète grandement sur le cancer cellule caractéristiques². Le microenvironnement tumoral pourrait modifier expression de gènes/protéines de cellules du cancer et des caractéristiques phénotypiques, outre ANGIOGÉNÉTIQUE et potentiel métastatique. Le système de culture à deux dimensions (2d) in vitro manque également une matrice convenable, ce qui est nécessaire pour réguler la progression tumorale. Ainsi, en raison de ces limitations, en vivo modèles toujours devraient être utilisés pour appuyer les conclusions préliminaires de in vitro des modèles. Dans cette étude, nous utilisons la technologie de feuille de cellule à développer un modèle in vivo animal qui élucide le processus biologique qui sous-tendent la HCC.

Plus de dix ans, laboratoire de Okano mis en place une nouvelle méthode de l’ingénierie tissulaire, basé sur la cellule feuille technologie³. Cette technique utilise un plastique thermo-sensible de la culture pour permettre l’adhérence/détachement de cellule réversible en contrôlant l’hydrophobicité de la surface. Cette méthode permet une récolte douce des cellules cultivées en intact en trois dimensions (3d) forme (feuille de i.e.,cell), avec une bien gardé de la matrice extracellulaire (ECM) et les interactions cellule-cellule. La technique de feuille de cellule nécessite le PRELIMINAIRE de Pétri avec une poly(N-isopropylacrylamide) de température-responsive polymer (suis PIPA), qui est commercialement disponible et prêt à l’emploi. À une température inférieure à 20 ° C, polymères PIPA suis deviennent hydratées et dissolvent en solution aqueuse, considérant que, à une température plus élevée (37 ° C), les polymères sont déshydratent et se transforment en un précipité turbide. Le polymère contient des chaînes de l’amide hydrophile et chaînes latérales hydrophobes (groupes isopropyles). À des températures élevées, le mouvement brownien des molécules d’eau s’intensifie, considérant que, à basse température, les molécules de l’eau qui entoure les groupes isopropyle de la rupture de la structure hydratés et les groupes de l’isopropyl hydrophobe agréger en raison des interactions hydrophobes. Par conséquent, l’ensemble de la chaîne du polymère et agrégats précipite⁴.

Dans l’étude présentée, cette technique est employée pour développer un modèle animal de HCC à l’aide de trois feuillets cellulaires différentes. La première feuille employée se compose de HCC ligne cellules seulement, alors que les deux autres feuilles sont constitués d’une combinaison de cellules de la lignée cellulaire HCC et MSCs de deux sources différentes : MSCs (BMMSCs) de la moelle osseuse et du cordon ombilical MSCs (UCMSCs). MSCs sont des cellules stromales non hématopoïétiques capables de différencier les intocell dérivés de la lignée mésenchymateuse, incluant les adipocytes, les ostéocytes, les chondrocytes et les myocytes⁵. La raison pour laquelle que nous employons ces cellules lors de la création de la plaque de cellules de cancer est la contradiction du rapport sur l’effet de MSCs sur les cancers. Il a été suggéré que MSCs peuvent avoir deux phénotypes distincts : « MSC1 », un phénotype pro-inflammatoire et « MSC2 », un immunosuppresseur phénotype⁶. MSCs expriment des récepteurs toll-like (TLRs). TLR4 amorçage de MSCs augmente leur sécrétion de facteurs pro-inflammatoires, alors que l’amorçage TLR3 augmente leur sécrétion de facteurs immunosuppresseurs⁶. Une étude in vitro de ces deux phénotypes ont signalé qu’une co-culture de MSC1 avec des lignées de cellules cancéreuses atténue de croissance des cellules cancéreuses, tandis que MSC2 co-culture a l’ opposé de l’effet⁷. Cela implique que MSCs peuvent être Pro-cancer ou anticancéreux, selon leur phénotype. Ainsi, en plus de développer le modèle animal de HCC en utilisant la technologie de cellule feuille, nous voulons explorer l’effet des transplantations MSC sur le développement de tumeurs, ainsi qu’à l’aide de ces cellules va accroître ou réduire le développement de ce modèle.

Protocol

Le protocole suit les directives de protection des animaux du Comité d’éthique de l’Université du Roi Saoud. Interventions chirurgicales et anesthésiques autres médicaments utilisés pour les animaux sont approuvés par le Comité d’éthique de l’Université du Roi Saoud. Tous les travaux expérimentaux sont effectuée par un personnel convenablement formé. 1. cellule feuille Construction Enduire le Pétri (3,5 cm température Pétri) de sérum non dilué fœtal (SVF) e…

Representative Results

Tumorigénicité des feuilles de transplantation cellulaire chez les Rats : Un mois après la transplantation, toutes les feuilles de cellules transplantées dans le foie des rats ont développé des tumeurs (Figure 3). La taille moyenne des tumeurs développées de HepG2, HepG2/BMMSC et les feuilles de cellulaire HepG2/UCMSC étaient de 4,5 cm, 4 cm et 2,5 cm, respectivement<sup c…

Discussion

Une quantité considérable de recherche se consacre au développement adéquat en vivo précliniques modèle animal qui ressemble à des cancers humains. Actuellement, les principales approches utilisées pour créer des modèles animaux de cancer impliquent de transplantation de génie génétique et la cellule¹¹. Modèles animaux génétiquement modifiés sont de bons outils pour l’identification et la validation des gènes cibles, ainsi que la compréhension des mécanismes molécul…

Materials

Reagents
FBS	Gibco/Invitrogen	10270106
DMEM high glucose	Sigma	D5671-500ML
Penicillin/streptomycin	Life Technology	15070063
Sterile physiologic saline	Sigma	S0817-1GA
Human HepG2 cell line	ATCC, USA	HB-8065
Human bone marrow MSCs cell line	PromoCell, USA	C-12974
human umbilical cord tissue MSCs	PromoCell, USA	C-12971
Ketamine 50%	Rompun, Bayer
Xylazine 2%	Rompun	23076-35-9
Alphadine® solution.	Riyadh Pharma	LBL0816
Disposables:
15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube	Falcon	352097
3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane)	Sigma	174904-1CS
100-1000 µl  Pipette Tips	Sigma	CLS4868-1000EA
Basic Procedure Drape	Thermofisher	PMD5293.0
Equipment
Plus pipette, variable volume	Eppendorf® Research®	Z683779-1EA
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2	Any brand
Biological safety cabinet	Any brand
Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2	Any brand
Sterile surgical tools and nude rats:
Forceps
Scissors
scalpel
Nylon Suture  5-0	Accutome	AB-3854S	Monofilament, Lancet
1 ml Tuberculin Syringes	Fisher Scientific	14-826-88
Nude rats	Charles river