Ermittlung des Potenzials von mesenchymalen Stammzellen Blatt auf die Entwicklung des hepatozellulären Karzinoms In Vivo
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Entwicklung eines in-Vivo Krebs-Modells mit Blatt-Zelltechnologie. Ein solches Modell könnte sehr nützlich für die Bewertung der Anti-Krebs-Therapie.
Abstract
In Vivo Tiermodell, das menschlichen Krebs nachahmt hätten verschiedene Anwendungen, die signifikante klinische Informationen liefern. Die derzeit verwendeten Techniken für die Entwicklung von in Vivo Krebs-Modelle haben erhebliche Einschränkungen. Daher wollen wir in dieser Studie Zelle Blatt Technologie um eine in-Vivo -Krebs-Modell zu entwickeln, zu implementieren. Das Leberzellkarzinom (HCC) ist erfolgreich in nackten Ratten mit Zelle Sheets erstellt von HCC Zelle Zeile Zellen entwickelt. Die Krebs Zelle Blätter entstehen durch intrazelluläre Adhäsion und die Bildung von eine geschichtete Struktur, durch die extrazelluläre Matrix gesteuert. Dies ermöglicht die HCC-Blatt-Transplantation in die Leber und die Schaffung einer Tumor-tragenden Tiermodell innerhalb eines Monats. Darüber hinaus ist die Rolle von mesenchymalen Stammzellen (MSC) an der Entwicklung dieses Modells Krebs untersucht. Neben dem HCC Zelle Zeile Blatt, eine andere Zelle zwei Blätter entstehen: ein Blatt HCC Zellen und Knochenmark MSCs (BMMSCs) und ein Blatt von HCC Zellen und Nabelschnur MSCs (UCMSCs). Blätter, die eine von HCC Zellen und MSCs Kombination sind auch in der Lage, eine Tumor-tragenden Tier. Aber die Zugabe von MSCs reduziert die Größe der der gebildete Tumor, und dieses negative Auswirkungen auf die Entwicklung von Tumoren variiert abhängig von der verwendeten MSCs-Quelle. Dies bedeutet, dass eine Zelle Blatt gemacht von bestimmten MSC-Subtypen bei Tumor-Verwaltung und Kontrolle genutzt werden könnte.
Introduction
HCC ist ein primärer Krebs der Leber, die signifikant mit einer schlechten Prognose assoziiert ist. Jährlich fast eine halbe Million neue Patienten mit HCC, was 85 % der Leberkrebs Patienten weltweit1diagnostiziert. Hepatocarcinogenesis ist keine einzelne Form Krankheit; Vielmehr ist es eine Sammlung von Krankheiten, die verschiedene histopathologische Merkmale und genetische und genomic Variabilität, zusätzlich zu haben prognostische Ergebnisse1vielfältig. Daher sind die größten Herausforderungen bei der Entwicklung einer effektiven therapeutischen Strategie für HCC die begrenzten Kenntnissen der HCC-Biologie und der Mangel an geeigneten experimentellen Tiermodell, die helfen können, diese komplexe Krankheit zu verstehen. In Vivo Tiermodell, das menschlichen Krebs nachahmt ist notwendig für die Auswahl von Kandidatengenen und Identifizierung prognostische/prädiktive Marker verwickelt in Krebs-Induktion, sowie für die Untersuchung von verschiedener Faktoren, die Krebs Antworten beeinflussen können zu Therapeutika.
In-vitro- Studien sind noch mit großen Einschränkungen verbunden. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass Krebszellen viele ihre in Vivo -Funktionen verlieren wenn in Kultur gepflegt. Die Änderungen, die an Zellen in Vitro Ergebnis aus dem Fehlen der ganze Gewebe Physiologie in einer ex-Vivo -Umgebung auftreten. Krebs Zell-Zell-Interaktion (Stromazellen, immun-, Gefäßsystem, epithelialen, etc.) innerhalb der Tumor Mikroumgebung reflektiert stark Krebs Zelle Eigenschaften2. Der Tumor Mikroumgebung könnte Krebs Zelle gen/Protein-Expression und phänotypischen Eigenschaften, neben angiogenetischer und metastasiertem Potenziale verändern. Das zweidimensionale (2D) in-vitro- Kultur-System fehlt auch eine geeignete Gewebe-Matrix, die Tumorprogression regulieren muss. Daher sollten aufgrund dieser Einschränkungen in Vivo Modellen immer genutzt werden, um die vorläufigen Ergebnisse der in-vitro- Modelle unterstützen. In dieser Studie verwenden wir Blatt Zelltechnologie in Vivo Tiermodell zu entwickeln, die den gesamten biologischen Prozess zugrunde liegenden HCC erläutert.
Vor mehr als einem Jahrzehnt etablierte Okano Labor eine neuartige Methode des Tissue Engineering basierend auf Zelle Blatt Technologie3. Diese Technik nutzt einen Thermo-responsive Kultur Kunststoff um reversible Zelle Adhäsion/Ablösung zu ermöglichen, durch die Kontrolle der Oberfläche Hydrophobie. Diese Methode ermöglicht eine schonende Ernte von kultivierten Zellen in einem intakten dreidimensionale (3D) Format (i.e.,cell Blatt), mit einem gepflegten extrazelluläre Matrix (ECM) und Zell-Zell-Interaktionen. Die Zelle Blatt Technik erfordert vorbeschichten Kultur Gerichte mit einem Temperatur-responsive Polymer-poly(N-isopropylacrylamide) (PIPA bin), die kommerziell verfügbar und einsatzbereit. Bei einer Temperatur unter 20 ° C PIPA bin Polymere werden hydratisiert und lösen sich in wässrigen Lösungen, in der Erwägung, dass bei einer höheren Temperatur (37 ° C), Polymere dehydriert und verwandeln Sie in eine trübe Niederschlag. Das Polymer enthält hydrophilen Amid Ketten und hydrophoben Seitenketten (Isopropyl-Gruppen). Bei hohen Temperaturen wird die Brownsche Bewegung der Wassermoleküle in der Erwägung, dass bei einer niedrigen Temperatur der Wassermoleküle rund um die Isopropyl-Gruppen des Zusammenbruches hydratisiert Struktur und die Gruppen der hydrophoben Isopropyl aggregieren intensiviert, durch hydrophobe Wechselwirkungen. Daher ist die gesamte Kette des Polymers aggregiert und Ausscheidungen4.
In der vorgestellten Studie wird diese Technik eingesetzt, um ein HCC Tiermodell mit drei verschiedenen Zelle Blätter entwickeln. Das erste Blatt beschäftigt besteht aus HCC Zelle Zeile Zellen nur, während die anderen beiden Blätter aus einer Kombination von HCC Zelle Zeile Zellen und MSCs aus zwei verschiedenen Quellen besteht: Knochenmark MSCs (BMMSCs) und Nabelschnur MSCs (UCMSCs). MSCs sind nicht blutbildende Stromatumoren Zellen, die in der Lage sind Intocell Derivate der mesenchymalen-Linie, inklusive Adipozyten, Osteozyten, Chondrozyten, Myozyten5zu unterscheiden. Der Grund, warum wir diese Zellen beschäftigen, bei der Erstellung der Krebs Zelle Blatt ist die inkonsistente Berichterstattung über die Wirkung von MSCs auf Krebserkrankungen. Es wurde darauf hingewiesen, dass MSCs zwei verschiedene Phänotypen haben können: “MSC1”, einem proinflammatorischen Phänotyp und “MSC2”, eine immunsuppressive Phänotyp-6. MSCs express Toll-Like-Rezeptoren (TLR). TLR4 grundieren der MSCs erhöht ihre Absonderung von proinflammatorischen Faktoren, während TLR3 Grundierung ihrer Sekretion von immunsuppressiven Faktoren6erhöht. Eine in-vitro- Studie über diese zwei Phänotypen berichtet, dass ein Kokulturen MSC1 mit Krebszelllinien Wachstum von Krebszellen, gedämpft, während MSC2 kokultur die entgegengesetzte Wirkung7hatte. Das bedeutet, dass MSCs pro-Krebs oder Krebs, je nach deren Phänotyp sein können. So wollen wir neben der Entwicklung der HCC-Tiermodell mit Blatt-Zelltechnologie, die Wirkung des MSC Transplantationen auf Tumorentwicklung, erkunden und ob diese Zellen erhöhen oder verringern die Entwicklung dieses Modells.
Protocol
Representative Results
Discussion
Umfangreiche Forschung widmet sich der Entwicklung angemessene in-Vivo präklinischen Tiermodell, das menschliche Krebsarten ähnelt. Derzeit umfassen die wichtigsten Ansätze zur Erstellung von Krebs Tiermodellen Gentechnik und Cell Transplantation11. Gentechnisch veränderte Tiermodelle sind gute Tools zur Identifizierung und Validierung von Zielgenen, sowie das Verständnis der molekularen Mechanismen, die Medikamenten-induzierten Toxizität. Dieses Modell ist jedoch mit einigen Einsch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten den Mitarbeitern der experimentellen Chirurgie und Tier Labor am College of Medicine, König-Saud-Universität, für ihre Zusammenarbeit und Unterstützung vor allem Hussain Almukhayzim und Hisham Aloudah danken. Die Autoren möchte auch das Medienteam König Saud bin Abdul-Aziz University anerkennen, für die Vorbereitung des visuelles Materials vor allem Muath bin Ghannam und Abdulwahab Alsulami.
Materials
| Reagents | |||
| FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
| Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
| Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
| Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
| human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
| Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
| Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
| Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
| Disposables: | |||
| 15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
| 3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
| 100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
| Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
| Equipment | |||
| Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Biological safety cabinet | Any brand | ||
| Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Sterile surgical tools and nude rats: | |||
| Forceps | |||
| Scissors | |||
| scalpel | |||
| Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
| 1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Nude rats | Charles river | ||
References
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