Esplorare il potenziale delle cellule staminali mesenchimali foglio sullo sviluppo di Carcinoma epatocellulare In Vivo
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per sviluppare un modello in vivo del cancro utilizzando tecnologia dello strato delle cellule. Tale modello potrebbe essere molto utile per la valutazione delle terapie anticancro.
Abstract
Un in vivo modello animale che imita cancro umano potrebbe avere varie applicazioni che forniscono le informazioni cliniche significative. Le tecniche attualmente utilizzate per lo sviluppo di modelli di cancro in vivo hanno notevoli limitazioni. Pertanto, in questo studio, miriamo a implementare la tecnologia dello strato delle cellule per sviluppare un modello di cancro in vivo . Carcinoma epatocellulare (HCC) è sviluppato con successo in nudi ratti utilizzando fogli di cella create da cellule di HCC cella linea. I fogli di cellule di cancro sono generati tramite adesione intracellulare e la formazione di una struttura stratificata, controllata dalla matrice extracellulare. Ciò consente il trapianto di foglio HCC in fegato e la creazione di un modello animale del tumore-cuscinetto entro un mese. Inoltre, il ruolo delle cellule staminali mesenchimali (MSC) nello sviluppo di questo modello di cancro è studiato. Oltre il foglio di linea delle cellule HCC, un’altra cella due fogli vengono creati: un foglio delle cellule HCC e midollo osseo MSCs (BMMSCs) e un foglio di cellule di HCC e cordone ombelicale MSCs (UCMSCs). Fogli che hanno una combinazione di entrambe le cellule HCC e MSCs sono anche in grado di produrre un animale del tumore-cuscinetto. Tuttavia, l’aggiunta di MSCs riduce le dimensioni del formato di tumore, e questo effetto negativo sullo sviluppo del tumore varia a seconda origine dei MSCs usate. Questo indica che una lastra cella determinati sottotipi MSC poteva essere utilizzata nel controllo e gestione di tumore.
Introduction
HCC è un cancro primario del fegato che è significativamente associato con una prognosi difficile. Ogni anno, quasi mezzo milione nuovi pazienti sono diagnosticati con HCC, che rappresenta 85% dei pazienti di cancro del fegato nel mondo1. Hepatocarcinogenesis non è una malattia di form singolo; piuttosto, è una collezione di malattie che hanno differenti caratteristiche istopatologiche e variabilità genetica e genomica, oltre alla varia prognostici risultati1. Di conseguenza, le principali sfide nello sviluppo di un’efficace strategia terapeutica per HCC sono la limitata conoscenza della biologia HCC e la mancanza di un modello animale sperimentale adatto che può aiutare a capire questa complessa malattia. Un in vivo modello animale che imita cancro umano è necessario per la selezione di geni candidati e identificazione di marcatori prognostici/predittivi implicati nell’induzione del cancro, così come per lo studio di diversi fattori che possono influenzare le risposte del cancro agli agenti terapeutici.
Gli studi in vitro del cancro sono ancora associati con grossi limiti. Questo è dovuto al fatto che le cellule tumorali perdono molte delle loro caratteristiche in vivo quando mantenute in coltura. I cambiamenti che si verificano a cellule in vitro risultato dall’assenza della fisiologia del tessuto intero in un ambiente ex vivo . Interazione cellula–cellula di cancro (stromal, immunitario, sistema vascolare, epiteliali, ecc.) all’interno del microambiente tumorale riflette notevolmente il cancro delle cellule caratteristiche2. Il microambiente tumorale potrebbe alterare l’espressione proteina/del gene del cancro delle cellule e delle caratteristiche fenotipiche, oltre angiogenetici e potenzialità metastatica. Il sistema di cultura bidimensionale (2D) in vitro manca anche una matrice di tessuto adatto, che è necessaria regolare la progressione del tumore. Così, a causa di queste limitazioni, in vivo modelli dovrebbero sempre essere utilizzati per supportare i risultati preliminari di modelli in vitro . In questo studio, usiamo la tecnologia dello strato delle cellule per sviluppare un in vivo modello animale che delucida il completo processo biologico sottostante HCC.
Più di un decennio fa, laboratorio di Okano stabilito un metodo novello di ingegneria tissutale basata sulla cella foglio tecnologia3. Questa tecnica utilizza una plastica termo-sensibile cultura per consentire l’adesione/distacco cellulare reversibile controllando l’idrofobicità di superficie. Questo metodo consente una delicata raccolta di cellule coltivate nel formato di un intatto tridimensionale (3D) (foglio i.e.,cell), con una curatissima matrice extracellulare (ECM) e le interazioni cellula–cellula. La tecnica di strato delle cellule richiede la spre-spalmatura di piastre di coltura con un polimero termosensibile PNIPPA (PIPA Am), che è commercialmente disponibile e pronto per l’uso. Ad una temperatura inferiore a 20 ° C, PIPA sono polimeri diventano idratati e si dissolvono in soluzioni acquose, considerando che, ad una temperatura superiore (37 ° C), i polimeri diventano disidratati e trasformano in un precipitato torbido. Il polimero contiene catene ammide idrofila e catene laterali idrofobe (gruppi isopropilico). Alle alte temperature, si intensifica il movimento browniano delle molecole d’acqua, considerando che, a bassa temperatura, le molecole dell’acqua che circonda i gruppi isopropilico della ripartizione struttura idratata e i gruppi di isopropile idrofobo aggregare a causa di interazioni idrofobiche. Di conseguenza, l’intera catena del polimero aggrega e precipitati4.
Nello studio presentato, questa tecnica è impiegata per sviluppare un modello animale di HCC con tre fogli differenti delle cellule. Il primo foglio impiegato è costituito da cellule di HCC cella linea solo, mentre gli altri due fogli sono costituiti da una combinazione di cellule della linea cellulare HCC e MSCs da due origini diverse: midollo osseo MSCs (BMMSCs) e del cordone ombelicale MSCs (UCMSCs). MSCs sono non-emopoietici cellule stromale che sono capaci di differenziazione intocell derivati del lignaggio mesenchymal, inclusi adipociti, osteociti, condrociti e miociti5. La ragione che ci avvaliamo di queste cellule, durante la creazione di strato di cellule di cancro è la segnalazione incoerente sull’effetto di MSCs sui cancri. È stato suggerito che MSCs può avere due fenotipi distinti: “MSC1”, un fenotipo proinfiammatorio e “MSC2”, un fenotipo immunosoppressivo6. MSCs esprimono recettori toll-like (TLR). TLR4 adescamento di MSCs aumenta la secrezione di fattori proinfiammatori, mentre TLR3 innesco aumenta la loro secrezione di fattori immunosoppressivi6. Uno studio in vitro di questi due fenotipi ha riferito che una co-coltura di MSC1 con linee cellulari del cancro attenuata la crescita della cellula tumorale, mentre MSC2 co-coltura ha avuto l’ effetto opposto7. Ciò implica che MSCs può essere Pro-cancro o anticancro, a seconda del loro fenotipo. Così, oltre a sviluppare il modello animale di HCC utilizzando tecnologia dello strato delle cellule, vogliamo esplorare l’effetto del trapianto di MSC sullo sviluppo del tumore, e se utilizzando queste cellule sarà aumentare o ridurre lo sviluppo di questo modello.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una vasta quantità di ricerca è dedicata allo sviluppo di un’adeguata in vivo animale modello preclinico analogo cancri umani. Attualmente, gli approcci principali utilizzati per creare modelli animali di cancro coinvolgono ingegneria genetica e delle cellule trapianto11. Modelli animali geneticamente modificati sono buoni strumenti per l’identificazione e la validazione dei geni bersaglio, come pure la comprensione dei meccanismi molecolari alla base di tossicità indotta da farmaci. T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare il personale della chirurgia sperimentale e laboratorio animale presso il College of Medicine, re Saud University, per la loro cooperazione e assistenza-soprattutto Hussain Almukhayzim e Hisham Aloudah. Gli autori inoltre desidera ringraziare il team di media King Saud bin Abdul-Aziz University per la preparazione di visual materiale-soprattutto Muath bin Ghannam e Abdulwahab Alsulami.
Materials
| Reagents | |||
| FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
| Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
| Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
| Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
| human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
| Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
| Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
| Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
| Disposables: | |||
| 15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
| 3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
| 100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
| Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
| Equipment | |||
| Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Biological safety cabinet | Any brand | ||
| Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Sterile surgical tools and nude rats: | |||
| Forceps | |||
| Scissors | |||
| scalpel | |||
| Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
| 1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Nude rats | Charles river | ||
References
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