Utforske potensialet av Mesenchymal stamceller ark på utvikling av leverkreft i Vivo
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å utvikle en i vivo kreft modellen med ark celleteknologi. Slik modell kan være svært nyttig for vurdering av anticancer therapeutics.
Abstract
En i vivo dyremodell som etterligner menneskelige kreft kan ha ulike programmer som leverer betydelige klinisk informasjon. For tiden brukte teknikker for utvikling av i vivo kreft modeller har betydelig begrensninger. Derfor i denne studien ønsker vi å implementere celleteknologi ark for å utvikle en i vivo kreft modell. Leverkreft (HCC) er utviklet i naken rotter ved hjelp av cellen ark opprettet fra HCC cellen linje celler. Kreft cellen arkene genereres gjennom intracellulær vedheft og dannelsen av en lagdelt struktur, kontrollert av den ekstracellulære matrisen. Dette gir HCC ark transplantasjon i leveren og etablering av en svulst-bærende dyr modell innen en måned. I tillegg er rollen mesenchymal stamceller (MSC) i utviklingen av denne kreft modellen undersøkt. I tillegg til HCC cellen linje arket, opprettes en annen to cellen ark: arket HCC celler og benmarg MSCs (BMMSCs) og et ark med HCC celler og navlestreng MSCs (UCMSCs). Ark som har en kombinasjon av både HCC celler og MSCs finnes også produsere en svulst-bærende dyr. Men tillegg av MSCs reduserer størrelsen på dannet svulsten, og denne virkning på tumor utvikling avhengig av brukte MSCs’ kilde. Dette indikerer at en celle ark av visse MSC subtyper kunne benyttes i svulst styring og kontroll.
Introduction
HCC er en primær kreft i leveren som er betydelig forbundet med en dårlig prognose. Årlig, nesten en halv million nye pasienter er diagnostisert med HCC, som representerer 85% av leveren kreft pasienter over hele verden1. Hepatocarcinogenesis er ikke en enkelt-skjema sykdom; Det er snarere en samling av sykdommer som har ulike histopathological funksjoner og genetiske og genomisk variasjon, i tillegg til variert prognostiske resultater1. Derfor er de største utfordringene i utviklingen av en effektiv terapeutisk strategi for HCC begrenset kunnskap om HCC biologi og mangelen på en passende eksperimentelle dyr modell som kan bidra til å forstå denne komplekse sykdommen. En i vivo dyremodell som etterligner menneskelige kreft er nødvendig for å velge kandidat gener og identifisere Prognostisk/forutsigende markører innblandet i kreft induksjon, samt for å undersøke ulike faktorer som kan påvirke kreft svar til terapeutisk agenter.
In vitro er kreft fortsatt forbundet med store begrensninger. Dette er skyldes at kreftcellene mister mange av deres i vivo funksjoner når vedlikeholdt i kultur. Endringene som skjer til celler i vitro resultat fra fraværet av hele vev fysiologi i ex vivo omgivelser. Kreft celle til celle interaksjon (stromal, immunsystemet, blodkar, epithelial, etc.) i svulst microenvironment reflekterer sterkt kreft celle egenskaper2. Svulst-microenvironment kan endre kreft cellen genet/protein uttrykk og fenotypiske egenskaper, i tillegg til angiogenetic og metastatisk potensial. Todimensjonal (2D) i vitro kultur systemet mangler også en egnet vev matrise, som er nødvendig å regulere svulst progresjon. Derfor, på grunn av disse begrensningene i vivo modeller skal alltid benyttes for å støtte de foreløpige funnene i vitro modeller. I denne studien bruker vi ark celleteknologi til å utvikle en i vivo dyremodell som kaster den fullstendig biologisk prosessen underliggende HCC.
Mer enn et tiår siden, etablert Okano’s laboratory en ny metode for tissue engineering basert på celle ark teknologi3. Denne teknikken utnytter en thermo-responsive kultur plast for å tillate reversibel celle vedheft/avdeling ved å kontrollere at overflaten hydrophobicity. Denne metoden tillater en skånsom høsting av kultivert celler i et intakt tredimensjonale (3D) format (i.e.,cell ark), med en godt bevart ekstracellulær matrix (ECM) og celle-til-celle interaksjoner. Cellen ark teknikken krever precoating kultur retter med en temperatur-responsive polymer poly(N-isopropylacrylamide) (PIPA er), som er kommersielt tilgjengelig og klar til bruk. En temperatur under 20 ° C, PIPA er polymerer blir hydrert og løses i vandige løsninger, mens ved en høyere temperatur (37 ° C), polymerer blir dehydrert og forvandle en grumset utløse. Polymer inneholder hydrofile amid kjeder og hydrofobe siden kjeder (isopropyl grupper). Ved høye temperaturer, er den Brownsk bevegelsen molekylene intensivert, mens en lav temperatur, molekylene i vannet rundt isopropyl gruppene for hydrert struktur og gruppene av hydrofobe isopropyl samle på grunn av hydrofobe interaksjoner. Derfor hele kjeden av polymer samler og precipitates4.
Presentert studien, er denne teknikken ansatt å utvikle en HCC dyremodell bruker tre ulike celle ark. Det første arket ansatt består av HCC cellen linje celler, mens de to andre arkene består av en kombinasjon av HCC cellen linje celler og MSCs fra to ulike kilder: benmarg MSCs (BMMSCs) og navlestreng MSCs (UCMSCs). MSCs er ikke-blodkreft stromal celler som kan skille intocell derivater av mesenchymal linjen, inkludert adipocytter, osteocytes, chondrocytes og myocytter5. Grunnen til at vi bruker disse cellene når du oppretter kreft cellen arket er inkonsekvent rapportering på effekten av MSCs på kreft. Det har blitt foreslått at MSCs kan ha to forskjellige fenotyper: “MSC1”, en proinflammatory fenotype, og “MSC2”, en suppressive fenotypen6. MSCs uttrykke toll-like reseptorer (TLRs). TLR4 fylling av MSCs øker deres utskillelsen av proinflammatory faktorer, mens TLR3 grunning øker deres utskillelsen av suppressive faktorer6. En i vitro studie av disse to fenotyper rapporterte at en co kultur av MSC1 med kreftcelle linjer dempes kreft cellevekst, mens MSC2 co kulturen hadde motsatt effekt7. Dette impliserer at MSCs kan være Pro kreft eller anticancer, avhengig av deres fenotypen. Derfor i tillegg utvikler HCC dyr modellen med ark celleteknologi, ønsker vi å utforske effekten av MSC transplantasjoner på tumor utvikling, og om bruker disse cellene vil øke eller redusere utviklingen av denne modellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
En omfattende mengde forskning er dedikert til å utvikle en tilstrekkelig i vivo prekliniske dyremodell som ligner kreft hos mennesker. For tiden innebære de store tilnærmingene brukt til å opprette kreft dyremodeller genteknologi og cellen transplantasjon11. Genmodifiserte dyr modeller er gode verktøy for identifikasjon og validering av målet gener, samt forstå molekylære mekanismer underliggende narkotikainduserte toksisitet. Men er denne modellen forbundet med noen begrensninge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke ansatte i eksperimentell kirurgi og dyr laboratorium ved College of Medicine, King Saud University, for deres samarbeid og støtte-spesielt Hussain Almukhayzim og Hisham Aloudah. Forfatterne vil også erkjenner medieteamet ved King Saud bin Abdul-Aziz University for å forberede visuelle materiale, spesielt Muath bin Ghannam og Abdulwahab Alsulami.
Materials
| Reagents | |||
| FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
| Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
| Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
| Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
| human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
| Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
| Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
| Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
| Disposables: | |||
| 15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
| 3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
| 100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
| Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
| Equipment | |||
| Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Biological safety cabinet | Any brand | ||
| Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
| Sterile surgical tools and nude rats: | |||
| Forceps | |||
| Scissors | |||
| scalpel | |||
| Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
| 1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Nude rats | Charles river | ||
References
- Marra, M., et al. Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview. Journal of Translational Medicine. 9, 171 (2011).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Kushida, A., et al. Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide). Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), e10088 (2010).
- Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis. PLoS One. 7 (9), e45590 (2012).
- Curtin, L. I., et al. Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats. Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).
- . Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats – ULAM Guidelines and SOPs – Michigan Medicine Confluence Available from: https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats (2017)
- Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models. PLoS One. 12 (8), e0184004 (2017).
- Russo, J., Russo, I. H. Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Current Drug Metabolism. 9 (5), 419-438 (2008).
- Driscoll, J. S. The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute. Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).
- Suzuki, R., Aruga, A., Kobayashi, H., Yamato, M., Yamamoto, M. Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering. Anticancer Research. 34 (9), 4747-4754 (2014).
- Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).
- Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. Cell sheet transplantation for heart tissue repair. Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).
- Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology. International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent?. Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).
