Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver um modelo câncer in vivo usando a tecnologia de célula de folha. Tal modelo poderia ser muito útil para a avaliação da terapêutica antineoplásica.
Em vivo modelo animal que imita o câncer humano poderia ter vários aplicativos que oferecem informação clínica significativa. As técnicas atualmente utilizadas para o desenvolvimento de modelos de câncer na vivo tem limitações consideráveis. Portanto, neste estudo, pretendemos implementar tecnologia de folha de célula para desenvolver um modelo de câncer na vivo . Carcinoma hepatocelular (HCC) é desenvolvido com sucesso em ratos nus usando folhas de célula criadas a partir de células de linha celular HCC. Os lençóis de células de câncer são gerados através de adesão intracelular e a formação de uma estrutura estratificada, controlada pela matriz extracelular. Isto permite o transplante de folha do HCC para o fígado e a criação de um modelo animal de tumor-rolamento dentro de um mês. Além disso, o papel das células-tronco mesenquimais (MSC) no desenvolvimento deste modelo de câncer é investigado. Além da folha de linha celular HCC, outro folhas de duas células são criadas: uma folha de células HCC e medula óssea MSCs (BMMSCs) e uma folha de células HCC e cordão umbilical MSCs (UCMSCs). Folhas com uma combinação de células HCC e MSCs também são capazes de produzir um animal de tumor-rolamento. No entanto, a adição de MSCs reduz o tamanho do tumor formado, e esse efeito adverso sobre o desenvolvimento do tumor varia de acordo com fonte do MSCs usados. Isto indica que uma folha de células de determinados subtipos MSC poderia ser utilizada no controle e gerenciamento do tumor.
HCC é um câncer primário do fígado que está significativamente associado um mau prognóstico. Anualmente, quase meio milhão novos pacientes são diagnosticados com HCC, representando 85% dos pacientes de câncer de fígado em todo o mundo1. Hepatocarcinogenesis não é uma doença de forma única; pelo contrário, é uma coleção de doenças que têm diferentes características histopatológicas e variabilidade genética e genômica, além de variados prognóstico resultados1. Portanto, os principais desafios no desenvolvimento de uma estratégia terapêutica eficaz para HCC são o limitado conhecimento da biologia HCC e a falta de um modelo animal experimental apropriado que pode ajudar a entender esta doença complexa. Em vivo modelo animal que imita o câncer humano é necessário para seleção de genes candidatos e identificar marcadores prognóstico/preditivo implicados na indução de câncer, bem como para a investigação de diferentes fatores que podem afetar respostas de câncer de agentes terapêuticos.
Estudos in vitro do câncer estão ainda associados com maiores limitações. Isto é devido ao fato de que as células cancerosas perdem muitas das suas características na vivo , quando mantidas em cultura. As mudanças que ocorrem em células em vitro resultado da ausência de fisiologia do tecido inteiro num cenário ex vivo . Interação de célula para célula de câncer (do estroma, imune, vascularização, epitelial, etc.) dentro do microambiente do tumor reflete muito sobre câncer célula características2. O microambiente do tumor pode alterar a expressão de gene/proteína de células de câncer e características fenotípicas, além de angiogenetic e potencial metastático. O sistema de cultura bidimensional (2D) em vitro também carece de uma matriz de tecido apropriado, o que é necessária regulamentar a progressão do tumor. Assim, devido a essas limitações, modelos em vivo devem sempre ser utilizados para apoiar as conclusões preliminares dos modelos em vitro . Neste estudo, nós usamos a tecnologia de folha de célula para desenvolver no vivo modelo animal que elucida o completo processo biológico subjacente HCC.
Mais de uma década atrás, laboratório do Okano estabeleceu um novo método de engenharia de tecidos, com base na célula folha tecnologia3. Esta técnica utiliza um plástico de cultura thermo-responsivo para permitir a aderência de célula reversível/destacamento controlando a hidrofobicidade de superfície. Este método permite uma suave colheita de culturas de células de formato um intacto tridimensional (3D) (folha i.e.,cell), com uma cuidada da matriz extracelular (ECM) e interações de célula para célula. A técnica de folha célula requer o precoating de pratos de cultura com uma temperatura-responsivo polímero poly(N-isopropylacrylamide) (sou de PIPA), que é comercialmente disponível e pronto para uso. A uma temperatura abaixo de 20 ° C, polímeros PIPA estou tornam-se hidratado e dissolve-se em soluções aquosas, Considerando que, a uma temperatura mais elevada (37 ° C), os polímeros tornar-se desidratado e transformam em um precipitado turvo. O polímero contém cadeias hidrofílicas de Amida e cadeias laterais hidrofóbicas (grupos de isopropil). Em altas temperaturas, o movimento browniano das moléculas de água se intensifica, Considerando que, em uma baixa temperatura, as moléculas de água circundantes isopropílico grupos do colapso da estrutura hidratado e os grupos hidrofóbico isopropílico agregar por causa de interações hidrofóbicas. Portanto, toda a cadeia do polímero agrega e precipita-se4.
No estudo apresentado, esta técnica é empregada para desenvolver um modelo animal de HCC, usando três folhas de célula diferente. A primeira folha de empregados é composto HCC célula linha células apenas, enquanto as outras duas folhas consistem em uma combinação de células de linha celular HCC e MSCs de duas fontes diferentes: MSCs da medula óssea (BMMSCs) e cordão umbilical MSCs (UCMSCs). MSCs são células do estroma não-hematopoiéticas que são capazes de diferenciar intocell derivados da linhagem mesenquimal, incluindo adipócitos, osteócitos, condrócitos e miócitos5. A razão pela qual que empregamos essas células, ao criar a camada de células de câncer é o relatórios inconsistentes sobre o efeito do MSCs em cânceres. Tem sido sugerido que o MSCs podem ter dois fenótipos distintos: “MSC1”, um fenótipo de proinflammatory e “MSC2”, um fenótipo imunossupressoras6. MSCs expressam receptores toll-like (TLRs). TLR4 escorva do MSCs aumenta sua secreção de fatores de proinflammatory, Considerando que o TLR3 escorva aumenta sua secreção de fatores imunossupressores6. Um estudo em vitro destes dois fenótipos relatou que uma cultura co de MSC1 com linhas de células de câncer atenuado o crescimento de células de câncer, enquanto MSC2 co-cultura teve o efeito oposto7. Isto implica que MSCs podem ser pro-câncer ou anticâncer, dependendo de seu fenótipo. Assim, além de desenvolver o modelo animal de HCC, usando a tecnologia de célula de folha, queremos explorar o efeito da MSC transplantes no desenvolvimento do tumor, e se usar essas células irão aumentar ou reduzir o desenvolvimento deste modelo.
Uma extensa quantidade de pesquisa é dedicada ao desenvolvimento de um adequada na vivo pré-clínicos modelo animal que se assemelha a cânceres humanos. Atualmente, as principais abordagens usadas para criar modelos animais câncer envolvem engenharia genética e células de transplantação11. Modelos de animais geneticamente modificados são boas ferramentas para a identificação e validação de genes-alvo, bem como compreender os mecanismos moleculares subjacentes a toxicidade ind…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostaria de agradecer a equipe de Cirurgia Experimental e laboratório de Animal da faculdade de medicina, rei Saud Universidade, pela sua cooperação e apoio-especialmente Hussain Almukhayzim e Hisham Aloudah. Os autores também gostaria de reconhecer a equipe de mídia da rei Saud bin Abdul-Aziz University para preparar o visual material-especialmente Muath bin Ghannam e Abdulwahab Alsulami.
Reagents | |||
FBS | Gibco/Invitrogen | 10270106 | |
DMEM high glucose | Sigma | D5671-500ML | |
Penicillin/streptomycin | Life Technology | 15070063 | |
Sterile physiologic saline | Sigma | S0817-1GA | |
Human HepG2 cell line | ATCC, USA | HB-8065 | |
Human bone marrow MSCs cell line | PromoCell, USA | C-12974 | |
human umbilical cord tissue MSCs | PromoCell, USA | C-12971 | |
Ketamine 50% | Rompun, Bayer | ||
Xylazine 2% | Rompun | 23076-35-9 | |
Alphadine® solution. | Riyadh Pharma | LBL0816 | |
Disposables: | |||
15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube | Falcon | 352097 | |
3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane) | Sigma | 174904-1CS | |
100-1000 µl Pipette Tips | Sigma | CLS4868-1000EA | |
Basic Procedure Drape | Thermofisher | PMD5293.0 | |
Equipment | |||
Plus pipette, variable volume | Eppendorf® Research® | Z683779-1EA | |
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
Biological safety cabinet | Any brand | ||
Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2 | Any brand | ||
Sterile surgical tools and nude rats: | |||
Forceps | |||
Scissors | |||
scalpel | |||
Nylon Suture 5-0 | Accutome | AB-3854S | Monofilament, Lancet |
1 ml Tuberculin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
Nude rats | Charles river |