JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생화학

Definere Hsp33's Redox-regulerede anstandsdame aktivitet og kortlægning konformationelle ændringer på Hsp33 ved hjælp af brint-deuterium Exchange massespektrometri

Published: June 07, 2018
doi:
10.3791/57806
, , ,
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram,The Hebrew University of Jerusalem

Summary

En af de mest udfordrende stressforhold, at organismer støder på i løbet af deres levetid medfører ophobning af oxidanter. Under oxidative stress afhængige celler stærkt molekylære chaperoner. Vi præsenterer her, metoder, der anvendes til at undersøge den redox-regulerede anti-sammenlægning aktivitet, samt for at overvåge strukturelle ændringer vedrørende den anstandsdame funktion bruger HDX-MS.

Abstract

Levende organismer skal jævnligt håndtere svingende miljøer i løbet af deres livscyklus, herunder ændringer i temperatur, pH, ophobning af reaktive ilt arter og meget mere. Disse udsving kan føre til en udbredt protein udfoldning, sammenlægning, og celle død. Celler har derfor udviklet sig et dynamisk og stress-specifikke netværk af molekylære chaperoner, der opretholder en “sund” proteomet under stress betingelser. ATP-uafhængig chaperoner udgør en stor klasse af molekylære chaperoner, der tjener som første linje forsvar molekyler, beskyttelse mod protein sammenlægning i en stress-afhængige måde. En funktion disse chaperoner har tilfælles er deres evne til at udnytte strukturfondene plasticitet for deres stress-specifik aktivering, anerkendelse og frigivelse af fejlfoldede klient.

I dette papir fokuserer vi på den funktionelle og strukturelle analyse af en sådan uløseligt uordnede anstandsdame, den bakterielle redox-regulerede Hsp33, der beskytter proteiner imod sammenlægning under oxidativt stress. Vi præsenterer her, en værktøjskasse med forskellige teknikker for at studere redox-regulerede anstandsdame aktivitet og for kortlægning konformationelle ændringer af anstandsdame, ligger til grund for sin aktivitet. Specifikt, vi beskriver en arbejdsproces, der omfatter forberedelse af fuldt reduceret og fuldt oxideret proteiner, efterfulgt af en analyse af den anstandsdame anti-sammenlægning aktivitet in vitro- ved hjælp af lys-spredning, med fokus på graden af den anti-sammenlægning aktivitet og dens forsvindingskinetik. For at overvinde hyppige outliers akkumuleret under sammenlægning assays, beskriver vi brugen af Kfits, en roman grafisk værktøj, der giver mulighed for nem behandling af kinetic målinger. Dette værktøj kan let anvendes til andre typer af kinetic målinger for at fjerne outliers og montering kinetiske parametre. For at korrelere funktionen med protein struktur, vi beskriver opsætning og workflow af en strukturel massespektrometri teknik, brint-deuterium exchange-massespektrometri, der giver mulighed for kortlægning af konformationelle ændringer på anstandsdame og substrat i forskellige faser af Hsp33 aktivitet. Samme metode kan anvendes på andre protein-protein og protein-ligand interaktioner.

Introduction

Celler støder ofte på en ophobning af reaktive ilt arter (ROS) produceret som biprodukter af respiration1,2, proteiner og lipid oxidation3,4, og yderligere processer5, 6,7. Trods ROS’ gavnlig rolle i forskellige biologiske processer såsom cellulær signalering8,9 og immunrespons10, kan en ubalance mellem ROS produktion og dets afgiftning forekomme, fører til oxidativ understrege7. De biologiske mål af ROS er proteiner, lipider og nukleinsyrer, oxidation af som påvirker deres struktur og funktion. Derfor er ophobning af cellulære oxidanter stærkt knyttet til en række forskellige sygdomme herunder kræft9,11, betændelse12,13, og aging14, 15, og er blevet fundet for at være involveret i starten og progression af neurodegenerative sygdomme såsom Alzheimers, Parkinsons og ALS sygdom16,17,18.

Både nyligt syntetiserede og modne proteiner er meget følsom over for oxidation på grund af de potentielt skadelige ændringer af deres sidekæder, der former protein struktur og funktion19,20. Derfor fører oxidativt stress som regel til en udbredt protein inaktivering, misfoldning og sammenlægning, i sidste ende fører til celledød. En af de elegante cellulære strategier til at håndtere de potentielle skader af protein oxidation er at udnytte redox-afhængige chaperoner, som hæmmer udbredt protein sammenlægning, i stedet for at danne stabile komplekser med fejlfoldede klient proteiner21 ,22,23. Disse første linje forsvar chaperoner aktiveres hurtigt ved en lokationsspecifik oxidation (normalt på cystein restkoncentrationer), der konverterer dem til potente anti-sammenlægning molekyler24. Da oxidativt stress resulterer i hæmning af respiration og i fald i cellulære ATP niveauer25, er kanoniske ATP-afhængige chaperoner mindre effektive under oxidative stress betingelser25,26 ,27. Derfor, redox-aktiveret ATP-uafhængig chaperoner spiller en afgørende rolle i at opretholde protein homøostase ved ophobning af oxidanter i bakterier og eukaryoter (fx, Hsp3328 og RidA29 i bakterier, Get330 i gær, peroxiredoxins31 i eukaryoter). Aktiviteten af disse chaperoner afhænger kraftigt reversible konformationelle strukturændringer fremkaldt af en lokationsspecifik oxidation, der afdækker hydrofobe regioner involveret i anerkendelse af fejlfoldede klient proteiner.

Forskning af den anti-sammenlægning mekanisme og principperne for anerkendelse af klient proteiner af chaperoner er ikke let følge af anstandsdame-substrat interaktioner32,33, dynamisk og heterogenic 34,35,36,37. Stress-regulerede chaperoner har dog mulighed for at fremme vores forståelse af den anti-akkumuleringsfunktion på grund af deres evne til at: 1) få to forskellige former af den anstandsdame, aktiv (fxoxideret) og inaktive (f.eks. reduceret), med introduktion eller fjernelse af en stress tilstand let skifte mellem dem (f.eks., oxidant og reduktionsmiddel), 2) har en bred vifte af substrater, 3) danner meget stabile komplekser med klienten proteiner, som kan evalueres ved forskellige strukturelle metoder, og 4) fokusere udelukkende på substrat anerkendelse og frigivelse, medieret af redox-afhængige konformationelle ændringer, som fleste af disse chaperoner mangler folde kapacitet.

Her analyserer vi den bakterielle redox-regulerede anstandsdame Hsp33’s anti-sammenlægning aktivitet, en vital komponent i den bakterielle forsvarssystem mod oxidation-induceret protein sammenlægning28. Når reduceret, er Hsp33 en stramt foldede zink-bindende protein med ingen anstandsdame aktivitet; men når de udsættes for oxidativt stress, Hsp33 undergår omfattende konformationelle ændringer, der udsætter sit Bæremateriale bindende regioner38,39. Ved oxidation er zinkion, der er stærkt bundet til fire meget bevaret cystein rester af domænet C-terminal frigivet40. Dette resulterer i dannelse af to disulfid obligationer, en udfoldelse af domænet C-terminal og en destabilisering af tilstødende linker region41. Regionerne C-terminal og linker er yderst fleksible og er defineret som uløseligt eller delvist uorganiseret. Efter tilbagevenden til ikke-stressforhold, cysteines blive reduceret og anstandsdame vender tilbage til sin oprindelige foldet tilstand med ingen anti-sammenlægning aktivitet. Hvorved man genfolder af anstandsdame fører til en yderligere udfoldelsen og destabilisering af bundne klient protein, der udløser sin overførsel til den kanoniske anstandsdame system, DnaK/J, for hvorved man genfolder38. Analyse af Hsp33’s interaktion websteder tyder på, at Hsp33 bruger begge sine opladet uordnede regioner samt de hydrofobe regioner linker og N-terminale domæne til at fange fejlfoldede klient proteiner og forhindre deres akkumulering38, 42. i den foldede tilstand, disse regioner er skjult af den foldede linker og C-terminale domæne. Interessant, fungerer regionen linker som gatekeeper af Hsp33’s foldede og inaktiv tilstand, “sensing” folde status af dets tilstødende C-terminale domæne34. Når destabiliseret af mutagenese (enten ved et punkt mutation eller en fuld sekvens undertrykkelse af netbårne), omdannes Hsp33 til et constitutively aktiv anstandsdame uanset redox tilstand af dens redox-følsomme cysteines43.

Protokollerne præsenteres her tillader overvågning af Hsp33’s redox-afhængige anstandsdame aktivitet, samt kortlægning konformationelle ændringer efter aktivering og binding af klient proteiner. Denne metode kan tilpasses forskning andre anstandsdame-klient anerkendelse modeller samt ikke-anstandsdame protein-protein interaktioner. Desuden præsenterer vi protokoller til forberedelse af fuldt reduceret og oxideret chaperoner, der kan bruges i undersøgelser af andre proteiner, redox-switch, til at afsløre potentielle roller af protein oxidation på protein aktivitet.

Specifikt, vi beskriver en metode til at overvåge anstandsdame aktivitet in vitro- og definere sit Bæremateriale specificitet under forskellige typer af protein sammenlægning (kemisk eller termisk induceret) ved hjælp af lysspredning (LS) målt ved et fluorospectrometer44. Under sammenlægning, lys spredning på 360 nm stiger hurtigt på grund af den stigende turbiditet. Således, sammenlægning kan overvåges på en tidsafhængig måde ved denne bølgelængde. LS er en hurtig og følsom metode til afprøvning af protein sammenlægning og dermed anti-sammenlægning aktiviteten af et protein af interesse ved hjælp af nanomolar koncentrationer, gør det muligt for karakterisering af protein sammenlægning-relaterede kinetiske parametre under forskellige betingelser. Derudover LS protokollen beskrevet her kræver ikke dyrt instrumentering, og let kan etableres i alle laboratorier.

Det er dog ganske udfordrende at få “rene” kinetic kurver og at udlede et protein kinetiske parametre fra sådanne lys spredning eksperimenter, på grund af støj og det store antal outliers genereret af luftbobler og store aggregater. For at overvinde denne hindring, præsenterer vi en roman grafisk værktøj, Kfits45, anvendes for at reducere støjniveauet i forskellige kinetic målinger, specielt udstyret til protein sammenlægning kinetiske data. Denne software giver foreløbige kinetiske parametre for en tidlig vurdering af resultaterne og tillader brugeren at “rense” store mængder data hurtigt uden at påvirke dets kinetiske egenskaber. Kfits er implementeret i Python og tilgængelige i open source på 45.

En af de udfordrende spørgsmål i feltet vedrører kortlægning interaktion steder mellem chaperoneproteiner og deres klient proteiner og forstå, hvordan chaperoner genkende en bred vifte af fejlfoldede substrater. Dette spørgsmål er yderligere kompliceret, når studerer højdynamiske proteinkomplekser, der involverer uløseligt uordnede chaperoneproteiner og sammenlægning-tilbøjelige substrater. Heldigvis, strukturelle massespektrometri har dramatisk Avanceret i det sidste årti og har med held givet nyttige metoder og værktøjer til at analysere den strukturelle plasticitet og kortlægge restkoncentrationer involveret i protein anerkendelse46, 47 , 48 , 49. her, præsenterer vi en sådan teknik-brint-deuterium exchange massespektrometri (HDX-MS)-som giver mulighed for kortlægning af rest-niveau ændringer i en strukturel kropsbygning ved protein ændring eller protein/Ligand bindende35, 50,51,52,53,54,55. HDX-MS bruger kontinuerlig udveksling af rygraden brintatomer af deuterium, sats som er påvirket af det kemiske miljø, tilgængelighed og kovalente og kovalente bindinger56. HDX-MS spor disse exchange processer ved hjælp af en deutereret opløsningsmiddel, almindeligt tungt vand (D2O), og tillader måling baseret på ændringen i Molekylær vægt efter brint til deuterium exchange. Langsommere satser for brint-deuterium exchange kan skyldes brintatomer deltager i brint obligationer eller, simpelthen, fra sterisk hindring, som viser lokale ændringer i struktur57. Ændringer på en ligand bindende eller posttranslationelle modifikationer kan også føre til forskelle i brint-miljø med en bindende resulterer i forskelle i brint-deuterium exchange (HDX) satser46,53.

Vi anvendte denne teknologi til 1) kort Hsp33 regioner, som hurtigt udvikler sig ved oxidation, fører til aktivering af Hsp33, og 2) definerer den potentielle bindende grænseflade af Hsp33 med dens fuld længde fejlfoldede substrat, citrat syntase (CS)38.

De metoder, der beskrives i dette håndskrift kan anvendes til at studere redox-afhængige funktioner af proteiner i vitro, definere anti-sammenlægning aktivitet og rollen af strukturelle ændringer (hvis nogen) i protein funktion. Disse metoder kan let tilpasses til forskellige biologiske systemer og anvendes i laboratoriet.

Protocol

1. forberedelse af fuldt reduceret og fuldt oxideret proteiner Forberedelse af en fuldt reduceret proteinBemærk: Her, vi beskriver reduktion af en zink-holdige proteiner, og brug en ZnCl2 løsning til at gendanne tilstanden Zn-indarbejdet, reduceret protein. ZnCl2 løsning kan udskiftes eller kasseres. Bemærk, at tid og temperatur reduktion proces afhænger af protein stabilitet og funktion, og er dermed bestemt pr. protein. Tø protein prøven på is og spi…

Representative Results

De to beskrevne metoder gør det muligt at følge den kinetiske aktivitet og dynamik af protein interaktioner mellem en anstandsdame og sit Bæremateriale. Derudover tillader reduktion-oxidation protokollen tilberedning af et fuldt reduceret og fuldt oxideret anstandsdame, at give en mere dybdegående forståelse af aktivering mekanisme af redox-afhængige uordnede chaperoner. Først, vi brugte lysspredning for at undersøge ans…

Discussion

I dette papir givet vi protokoller for analyse af aktivitet i redox-afhængige anstandsdame og karakterisering af strukturelle ændringer på bindingen af en klient protein. Disse er komplementære metoder til at definere potentielle anstandsdame-substrat komplekser og analysere potentielle samspil websteder.

Her, vi har anvendt disse protokoller til karakterisering af en kompleks mellem den redox-regulerede anstandsdame Hsp33 med velundersøgte anstandsdame substrat CS. Vi præsenteret to for…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne er taknemlig hen til Meytal Radzinski for hendes nyttige diskussioner og kritiske læsning af artiklen og Patrick Griffin og hans lab medlemmer for deres ubegrænset hjælp mens etablere HDX analyse platform. Forfatterne er taknemmelige for den tysk-Israel Foundation (I-2332-1149.9-2012), binationale Science Foundation (2015056), Marie Curie-integration grant (618806), Israel Science Foundation (1765/13 og 2629/16), og Human Frontier Science Program (CDA00064/2014) for deres finansielle støtte.

Materials

Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plus Sigma Aldrich 34998-2.5L solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich 252859 buffer
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 76-05-1 solvent
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
ZnCl2, Zinc Chloride Merck B0755416 308 reagent
DTT goldbio 27565-41-9 reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcare GE healthcare 29-9180-07 desalting column
Potassium Phosphate United states Biochemical Corporation 20274 buffer
Hydrogen peroxide 30% Merck K46809910526 oxidizing agent
citrate synthase sigma aldrich C3260 substrate
HEPES acid free sigma aldrich 7365-45-9 buffer
Gndcl sigma aldrich G3272-500G denaturant
Deuterium Chloride Solution sigma aldrich 543047-10G buffer
Deuterium Oxide 99% sigma aldrich 151882-100G solvent
TCEP bioworld 42000058-2 reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvette Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 Fluorospectrometer Jasco
Thermomixer Comfort Eppendorf 13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge Thermo Scientific
pH meter , PB-11 sartorius Sartorius 13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door COY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometer Thermo-Fischer Scientific
PAL system LHX – robotic system for handling HDX samples PAL system https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pump Thermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pump Thermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Data http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau) http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench software http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  2. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).
  3. Walker, C. L., Pomatto, L. C. D., Tripathi, D. N., Davies, K. J. A. Redox regulation of homeostasis and proteostasis in peroxisomes. Physiological Reviews. 98 (1), 89-115 (2018).
  4. Hohn, A., Konig, J., Jung, T. Metabolic syndrome, redox state, and the proteasomal system. Antioxidants & Redox Signaling. 25 (16), 902-917 (2016).
  5. Holmstrom, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
  6. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. . Free radicals in biology and medicine. , (2007).
  7. He, L., et al. Antioxidants maintain cellular redox homeostasis by elimination of reactive oxygen species. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 44 (2), 532-553 (2017).
  8. Bae, Y. S., Oh, H., Rhee, S. G., Yoo, Y. D. Regulation of reactive oxygen species generation in cell signaling. Molecules and Cells. 32 (6), 491-509 (2011).
  9. Giles, G. I. The redox regulation of thiol dependent signaling pathways in cancer. Current Pharmaceutical Design. 12 (34), 4427-4443 (2006).
  10. Qiao, J., et al. Regulation of platelet activation and thrombus formation by reactive oxygen species. Redox Biology. 14, 126-130 (2018).
  11. Milkovic, L., Siems, W., Siems, R., Zarkovic, N. Oxidative stress and antioxidants in carcinogenesis and integrative therapy of cancer. Current Pharmaceutical Design. 20 (42), 6529-6542 (2014).
  12. Duecker, R., et al. Oxidative stress-driven pulmonary inflammation and fibrosis in a mouse model of human ataxia-telangiectasia. Redox Biology. 14, 645-655 (2018).
  13. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxidants & Redox Signaling. 18 (6), 642-660 (2013).
  14. Jones, D. P. Redox theory of aging. Redox Biology. 5, 71-79 (2015).
  15. Labunskyy, V. M., Gladyshev, V. N. Role of reactive oxygen species-mediated signaling in aging. Antioxidants & Redox Signaling. 19 (12), 1362-1372 (2013).
  16. Kurian, P., Obisesan, T. O., Craddock, T. J. A. Oxidative species-induced excitonic transport in tubulin aromatic networks: potential implications for neurodegenerative disease. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 175, 109-124 (2017).
  17. Marinelli, P., et al. A single cysteine post-translational oxidation suffices to compromise globular proteins kinetic stability and promote amyloid formation. Redox Biology. 14, 566-575 (2018).
  18. Bozzo, F., Mirra, A., Carrì, M. T. Oxidative stress and mitochondrial damage in the pathogenesis of ALS: new perspectives. Neuroscience Letters. 636, 3-8 (2017).
  19. Lo Conte, M., Carroll, K. S. The redox biochemistry of protein sulfenylation and sulfinylation. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26480-26488 (2013).
  20. Reichmann, D., Jakob, U. The roles of conditional disorder in redox proteins. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 436-442 (2013).
  21. Suss, O., Reichmann, D. Protein plasticity underlines activation and function of ATP-independent chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 43 (2015).
  22. Voth, W., Jakob, U. Stress-activated chaperones: a first line of defense. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 899-913 (2017).
  23. Segal, N., Shapira, M. HSP33 in eukaryotes – an evolutionary tale of a chaperone adapted to photosynthetic organisms. The Plant Journal. 82 (5), 850-860 (2015).
  24. Dahl, J. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
  25. Winter, J., Linke, K., Jatzek, A., Jakob, U. Severe oxidative stress causes inactivation of DnaK and activation of the redox-regulated chaperone Hsp33. Molecular Cell. 17 (3), 381-392 (2005).
  26. Wang, J., Sevier, C. S. Formation and reversibility of BiP protein cysteine oxidation facilitate cell survival during and post oxidative stress. Journal of Biological Chemistry. 291 (14), 7541-7557 (2016).
  27. Zhang, H., et al. Glutathionylation of the bacterial Hsp70 chaperone DnaK provides a link between oxidative stress and the heat shock response. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6967-6981 (2016).
  28. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. Chaperone activity with a redox switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
  29. Muller, A., et al. Activation of RidA chaperone function by N-chlorination. Nature Communications. 5, 5804 (2014).
  30. Voth, W., et al. The protein targeting factor Get3 functions as ATP-independent chaperone under oxidative stress conditions. Molecular Cell. 56 (1), 116-127 (2014).
  31. Moon, J. C., et al. Oxidative stress-dependent structural and functional switching of a human 2-Cys peroxiredoxin isotype II that enhances HeLa cell resistance to H2O2-induced cell death. Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28775-28784 (2005).
  32. Wright, M. A., et al. Biophysical approaches for the study of interactions between molecular chaperones and protein aggregates. Chemical Communications. 51 (51), 14425-14434 (2015).
  33. Haslbeck, M., Vierling, E. A first line of stress defense: small heat shock proteins and their function in protein homeostasis. Journal of Molecular BIology. 427 (7), 1537-1548 (2015).
  34. Rimon, O., et al. A role of metastable regions and their connectivity in the inactivation of a redox-regulated chaperone and its inter-chaperone crosstalk. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (15), 1252-1267 (2017).
  35. Daturpalli, S., Kniess, R. A., Lee, C. T., Mayer, M. P. Large rotation of the N-terminal domain of Hsp90 is important for interaction with some but not all client proteins. Journal of Molecular Biology. 429 (9), 1406-1423 (2017).
  36. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. Journal of Biological Chemistry. 281 (24), 16493-16501 (2006).
  37. Koldewey, P., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A. Chaperone-client interactions: non-specificity engenders multifunctionality. Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12010-12017 (2017).
  38. Reichmann, D., et al. Order out of disorder: working cycle of an intrinsically unfolded chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
  39. Winter, J., Ilbert, M., Graf, P. C., Ozcelik, D., Jakob, U. Bleach activates a redox-regulated chaperone by oxidative protein unfolding. Cell. 135 (4), 691-701 (2008).
  40. Jakob, U., Eser, M., Bardwell, J. C. Redox switch of Hsp33 has a novel zinc-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 275 (49), 38302-38310 (2000).
  41. Ilbert, M., et al. The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (6), 556-563 (2007).
  42. Groitl, B., et al. Protein unfolding as a switch from self-recognition to high-affinity client binding. Nature Communications. 7, 10357 (2016).
  43. Cremers, C. M., Reichmann, D., Hausmann, J., Ilbert, M., Jakob, U. Unfolding of metastable linker region is at the core of Hsp33 activation as a redox-regulated chaperone. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11243-11251 (2010).
  44. Kumar, A., Mishra, S., Khan, E. Emerging methods for structural analysis of protein aggregation. Protein & Peptide Letters. 24 (4), 331-339 (2017).
  45. Rimon, O., Reichmann, D. Kfits: a software framework for fitting and cleaning outliers in kinetic measurements. Bioinformatics. 34 (1), 129-130 (2018).
  46. Percy, A. J., Rey, M., Burns, K. M., Schriemer, D. C. Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry – a review. Analytica Chimica Acta. 721, 7-21 (2012).
  47. Sinz, A. Divide and conquer: cleavable cross-linkers to study protein conformation and protein-protein interactions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 33-44 (2017).
  48. Sinz, A., Arlt, C., Chorev, D., Sharon, M. Chemical cross-linking and native mass spectrometry: a fruitful combination for structural biology. Protein Science. 24 (8), 1193-1209 (2015).
  49. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. Insights into eukaryotic translation initiation from mass spectrometry of macromolecular protein assemblies. Journal of Molecular Biology. 428, 344-356 (2016).
  50. Marciano, D. P., Dharmarajan, V., Griffin, P. R. HDX-MS guided drug discovery: small molecules and biopharmaceuticals. Current Opinion in Structural Biology. 28, 105-111 (2014).
  51. Mistarz, U. H., Brown, J. M., Haselmann, K. F., Rand, K. D. Probing the binding interfaces of protein complexes using gas-phase H/D exchange mass spectrometry. Structure. 24 (2), 310-318 (2016).
  52. Harrison, R. A., Engen, J. R. Conformational insight into multi-protein signaling assemblies by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Current Opinion in Structural Biology. 41, 187-193 (2016).
  53. Brown, K. A., Wilson, D. J. Bottom-up hydrogen deuterium exchange mass spectrometry: data analysis and interpretation. Analyst. 142 (16), 2874-2886 (2017).
  54. Vadas, O., Jenkins, M. L., Dornan, G. L., Burke, J. E. Using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry to examine protein-membrane interactions. Methods in Enzymology. 583, 143-172 (2017).
  55. Zanphorlin, L. M., et al. Heat shock protein 90 kDa (Hsp90) has a second functional interaction site with the mitochondrial import receptor Tom70. Journal of Biological Chemistry. 291 (36), 18620-18631 (2016).
  56. Hvidt, A., Nielsen, S. O. Hydrogen exchange in proteins. Advances in Protein Chemistry. 21, 287-386 (1966).
  57. Roberts, V. A., Pique, M. E., Hsu, S., Li, S. Combining H/D exchange mass spectrometry and computational docking to derive the structure of protein-protein complexes. 생화학. 56 (48), 6329-6342 (2017).
  58. Pascal, B. D., et al. HDX Workbench: software for the analysis of H/D exchange MS data. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (9), 1512-1521 (2012).

Tags

Hsp33Chaperone ActivityHydrogen-deuterium ExchangeMass SpectrometryOxidative StressProtein AggregationProtein DynamicsEnzyme InteractionsVisual Demonstration
check_url/kr/57806?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33’s Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image