JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme

Published: June 07, 2018
doi:
10.3791/57806
, , ,
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram,The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Organizmalar hayatları boyunca karşılaştığınız en zor stres koşulları oksidanlar birikimi içerir. Oksidatif stres sırasında hücreleri moleküler chaperones güveniyorsun. Burada, redoks düzenlenir anti-toplama etkinliği, de araştırmak için refakatçi işlev HDX-MS kullanarak yöneten yapısal değişiklikleri izlemek için kullanılan bir yöntem mevcut.

Abstract

Canlı organizmalar düzenli olarak dalgalanan ortamları ile sıcaklık, pH, reaktif oksijen türleri birikimi, daha fazla ve değişiklikleri de dahil olmak üzere kendi yaşam döngüsü sırasında başa çıkmak gerekir. Bu dalgalanmalar unfolding, bir yaygın protein için toplama, kurşun ve ölüm hücre. Bu nedenle, hücreleri “sağlıklı” Proteom stres koşullarında korumak moleküler chaperones dinamik ve stres özel ağının gelişmiştir. ATP bağımsız chaperones ilk satır savunma molekülleri, bir stres bağlı şekilde protein toplama karşı koruma olarak hizmet moleküler chaperones bir ana sınıfı oluşturur. Bu chaperones ortak olan bir özelliği yeteneğini kendi stres özgü etkinleştirme, tanıma ve misfolded istemci sürümü için yapısal plastisite kullanmak olmasıdır.

Bu yazıda, bir tür özünde düzensiz refakatçi, bakteriyel redoks düzenlenir Hsp33, proteinler oksidatif stres sırasında toplama karşı koruyan fonksiyonel ve yapısal analizi odaklanmak. Burada, kendi faaliyet altında yatan bir araç çeşitli teknikleri redoks düzenlenir refakatçi etkinlik eğitim için hem de refakatçi konformasyon değişiklikleri eşleştirmek için mevcut. Özellikle, biz tam olarak azaltılmış ve tam okside proteinler, ışık saçılım kullanarak, derecesi üzerinde odaklanan refakatçi anti-toplama etkinliği vitro analizine ardından hazırlanması içeren bir iş akışı tarif Anti-toplama etkinliği ve onun kinetik. Sık outliers toplama deneyleri sırasında biriken üstesinden gelmek için Kfits, kinetik ölçümleri kolay işlenmesini sağlayan yeni bir grafik araç kullanımını açıklar. Bu aracı kolayca diğer türleri kinetik ölçümlerin outliers kaldırma ve kinetik parametrelerin montaj için uygulanabilir. Işlev protein yapısı ile ilişkilendirmek için kurulum ve iş akışı bir yapısal kütle spektrometresi tekniği, refakatçi eşleme konformasyon değişikliklerinin sağlayan hidrojen-döteryum Satım kütle spektrometresi, tarif ve Hsp33 faaliyet farklı aşamalarında alt katman. Aynı metodoloji diğer protein-protein ve protein-ligand etkileşimleri için uygulanabilir.

Introduction

Hücreleri reaktif oksijen türleri (ROS) solunum1,2, protein ve lipit oksidasyon3,4ve ek işlemler5yan üretilen bir birikimi sık karşılaşırsanız, 6,7. ROS yararlı rolü rağmen8,9 ve bağışıklık yanıtı10sinyal cep gibi farklı biyolojik süreçleri, ROS üretim ve onun detoksifikasyon arasında bir dengesizlik, oksidatif için önde gelen ortaya çıkabilir 7stres. Biyolojik ROS, proteinler, lipidler ve nükleik asitler, bunların oksidasyon etkiler onların yapısı ve fonksiyonu hedefleridir. Bu nedenle, hücresel oksidanlar birikimi güçlü patolojiler kanser9,11, iltihap12,13ve yaşlanma14, de dahil olmak üzere çeşitli bir yelpazede bağlı olduğu 15ve başlangıçlı ve nörodejeneratif hastalıklar gibi Alzheimer, Parkinson’ın ilerlemesini ve ALS hastalığı16,17,18dahil olduğu tespit edilmiştir.

Hem yeni sentezlenmiş ve olgun protein oksidasyon protein yapısı ve fonksiyonu19,20şekil onların yan zincirlerinin zararlı olabilecek değişiklikler nedeniyle son derece duyarlıdır. Bu nedenle, oksidatif stres genellikle yaygın protein inactivation, misfolding ve toplama, sonunda hücre ölümüne giden yol açar. Protein oksidasyon olabilecek hasarları ile başa çıkmak için zarif hücresel stratejilerden birini yerine misfolded istemci protein21 ile kararlı kompleksler kurma yaygın protein toplama, inhibe redoks bağımlı chaperones kullanmaktır ,22,23. Bu ilk satır savunma chaperones hızla bunları güçlü anti-toplama molekülleri24dönüştürür bir siteye özgü oksidasyon (genellikle üzerinde sistein kalıntıları) tarafından etkinleştirilir. Oksidatif stres sonuçlar solunum inhibisyonu ve hücresel ATP düzeyleri25düşüşler beri kurallı ATP-bağımlı chaperones oksidatif stres koşulları25,26 sırasında daha az etkili ,27. Bu nedenle, redoks aktif ATP bağımsız chaperones oksidanlar bakteri ve ökaryotlar birikimi üzerine protein homeostazı korumak hayati bir rol oynamaktadır (Örneğin, Hsp3328 ve bakterilerde, Get3 RidA29 30 Maya, peroxiredoxins31 ökaryotlarda içinde). Bu chaperones etkinlik şiddetle hidrofobik bölgeler misfolded istemci proteinler tanıma dahil ortaya çıkaran bir siteye özgü oksidasyon tarafından indüklenen tersine çevrilebilir yapısal konformasyon değişiklikler bağlıdır.

Anti-toplama mekanizması ve istemci proteinler tanınması chaperones tarafından yöneten ilkeleri araştırma refakatçi-substrat etkileşimleri32,33dinamik ve heterogenic yapısı nedeniyle kolay değil, 34,35,36,37. Ancak, stres düzenlenir chaperones anti-toplama işlevi nedeniyle onların yetenek-e doğru bizim anlayışı ilerletmek için bir fırsat var: 1) refakatçi, (oksideÖrneğin,) etkin ve etkin olmayan (Örneğin, iki farklı türde elde giriş veya kolayca (Örneğin, oksidan ve indirgeyici), aralarında 2 geçiş bir stres durumu kaldırılması ile azaltılmış,)) yüzeyler, 3 geniş bir yelpazesi var) tarafından değerlendirilecek istemci proteinler ile son derece kararlı kompleksler oluşturur farklı yapısal metodolojisi ve 4) yalnızca substrat tanıma ve açıklaması, bu chaperones çoğunluğu katlama yeteneği yoksun olarak redoks bağımlı konformasyon değişikliklerden aracılı üzerinde odaklanmak.

Burada, bakteriyel redoks düzenlenir refakatçi Hsp33’ın anti-toplama etkinliği, oksidasyon kaynaklı protein toplama28karşı bakteriyel savunma sisteminin önemli bir bileşeni analiz. Azaltılmış, Hsp33 sıkıca katlanmış bir çinko-bağlayıcı protein hiçbir refakatçi etkinlik ile olur; Ancak, oksidatif strese maruz kaldığında, Hsp33, substrat bağlama bölgeleri38,39maruz kapsamlı konformasyon değişiklikler uğrar. Oksidasyon, C-terminal etki alanı dört son derece korunmuş sistein kalıntıları kuvvetle bağlı çinko iyon yayımlanan40olur. Bu iki disülfür bağları, bir C-terminal etki alanı ve bir istikrarsızlık bitişik bağlayıcı bölge41unfolding oluşumunda sonuçlanır. C-terminal ve bağlayıcı bölgeleri son derece esnektir ve özünde veya kısmen düzensiz olarak tanımlanır. Sigara stres koşulları döndüğünde, katıldı sınırlı olmak ve refakatçi hiçbir anti-toplama etkinlik ile yerel katlanmış durumuna döndürür. Refakatçi refolding daha fazla unfolding için yol açar ve refolding38için kanonik refakatçi sistem, DnaK/J, onun transfer tetikler ilişkili istemci protein destabilization. Onun dolu düzensiz bölgeler hem de hidrofobik bölgeler bağlayıcı ve N-terminal etki alanı yakalamak için Hsp33 kullanan her iki istemci proteinler misfolded ve önlemek onların toplama38, analiz Hsp33’ın etkileşim sitelerin öneriyor 42. katlanmış durumda katlanmış bağlayıcı ve C-terminal etki alanı tarafından bu bölgeler gizlidir. İlginçtir, bağlayıcı bölge “onun bitişik C-terminal etki alanı34katlama durumunu algılama” bir ağ geçidi denetleyicisi Hsp33’ın devletin, katlanmış ve etkin değil hizmet vermektedir. Bir kez mutagenesis (ya bir nokta mutasyon veya tam sırası pertürbasyon) tarafından dengeleri bozdu, Hsp33 bir yapısal etkin refakatçi ne olursa olsun onun redoks duyarlı katıldı43redoks durumunu dönüştürülür.

Burada sunulan iletişim kurallarına izin ver Hsp33’ın redoks bağımlı refakatçi etkinlik, yanı sıra etkinleştirme üzerine eşleme konformasyon değişiklikleri izleme ve istemci proteinlerin bağlama. Bu yöntem diğer refakatçi-müşteri tanıma modelleri yanı sıra refakatçi protein-protein etkileşimleri araştırma için adapte edilebilir. Ayrıca, biz potansiyel rolleri protein oksidasyon protein etkinlikte ortaya çıkarmak için başka redoks-anahtarı proteinlere çalışmalarında kullanılan tam olarak azaltılmış ve okside chaperones hazırlanması için protokolleri mevcut.

Özellikle, refakatçi etkinlik vitro izlemek ve onun substrat özgüllüğü (kimyasal olarak veya termal olarak ışık saçılma (LS) tarafından ölçülen kullanarak indüklenen) protein toplayıcı farklı türleri altında tanımlamak için bir yordam tarif bir fluorospectrometer44. Toplama sırasında hızla artan bulanıklık nedeniyle 360 nm artar, ışık saçılma. Böylece, toplama, bu dalga boyu bir saat-bağımlı şekilde izlenebilir. MU var protein toplama ve böylece bir protein nanomolar konsantrasyonları, protein toplama ile ilgili kinetik parametreleri altında farklı karakterizasyonu etkinleştirme kullanarak ilgi anti-toplama etkinliğini test etmek için hızlı ve hassas bir yöntem koşullar. Ayrıca, burada açıklanan LS Protokolü pahalı araçları gerektirmez ve kolayca herhangi bir laboratuvar olarak kurulabilir.

Yine de, “temiz” Kinetik eğriler elde etmek için ve deneyler, gürültü ve hava kabarcıkları ve büyük toplamları tarafından oluşturulan aykırı çok sayıda nedeniyle saçılma böyle ışık protein kinetik parametrelerin türetmek için oldukça zor. Bu engeli aşmak için biz mevcut bir roman grafik aracı, Kfits45gürültü seviyeleri özellikle protein toplama kinetik verileri için donatılmış farklı kinetik ölçümlerde azaltmak için kullanılan. Bu yazılım ön kinetik parametrelerin sonuçları erken bir değerlendirmesi için sağlar ve kullanıcının veri büyük miktarlarda hızlı bir şekilde kinetik özelliklerini etkilemeden temiz””. Kfits uygulanan Python ve 45açık kaynak mevcuttur.

Alanında zor sorulardan biri etkileşim siteleri chaperones ve onların istemci proteinler arasında eşleme ve nasıl tanımak chaperones misfolded yüzeylerde geniş bir anlama ile ilgilidir. Bu soruyu daha da özünde dahil son derece dinamik protein kompleksleri eğitim chaperones ve toplama eğilimli yüzeylerde düzensiz zaman karmaşık. Neyse ki, yapısal kütle spektrometresi son on yıl içinde önemli ölçüde ilerlemiştir ve başarılı bir şekilde yararlı yaklaşımlar ve yapısal plastisite analiz ve artıkları protein tanıma46, yer alan eşlemek için araçları sağlamıştır 47 , 48 , 49. burada, bir tür tekniği-hidrojen-döteryum Satım kütle spektrometresi (HDX-MS) mevcut-protein ve/veya protein/Ligand bağlayıcı35, üzerine yapısal bir biçimsel kalıntı düzeyinde yapılan değişiklikler eşleme sağlar 50,51,52,53,54,55. HDX-MS tarafından döteryum, hangi oranı kimyasal çevre tarafından erişilebilirlik, etkilenen omurga hidrojen sürekli değişimi kullanır ve kovalent ve Kovalent bağlar56. HDX-MS deuterated solvent, yaygın olarak “ağır su” (D2O) kullanarak bu satım işlemleri izler ve moleküler hidrojen döteryum Exchange’e takip ağırlık değişiklik dayalı ölçüm sağlar. Hidrojen-döteryum değişiminin daha yavaş gore hidrojen hidrojen bağları katılan veya, yerel değişikliklerde sonuçlanırsa yapısı57gösterir sadece, steric engel neden olabilir. Değişiklikleri bir ligand bağlayıcı veya translasyonel modifikasyon üzerine de farklılıklar hidrojen ortamda hidrojen-döteryum exchange (HDX) oranları46,53farklılıkları sonuçlanan bir bağlama ile yol açabilir.

Biz bu teknoloji hızla Hsp33, harekete geçirmek için önde gelen oksidasyon, üzerine açılmak ve 2) tanımlamak Hsp33 olası bağlama arayüzü, tam uzunlukta misfolded substrat, sitrat sentaz (CS)38ile 1) harita Hsp33 bölgelere uygulanır.

Bu el yazması açıklanan yöntemleri proteinler vitroanti-toplama etkinliği ve yapısal değişiklikler rolü (varsa) protein işlevinde tanımlama, redoks-bağımlı işlevler çalışmaya uygulanır. Bu metodolojileri kolayca farklı biyolojik sistemleri için uyarlanmış ve laboratuvar olarak uygulanır.

Protocol

1. tam olarak azaltılmış ve tam okside proteinler hazırlanması Tam olarak azaltılmış bir protein hazırlanmasıNot: Burada, biz bir çinko içeren protein ve Zn dahil, düşük protein durumuna için kullanım ZnCl2 çözüm azalma tarif. ZnCl2 çözüm yerine atılan veya. Not zaman ve sıcaklık azaltma işleminin protein istikrar ve işlev bağlıdır ve böylece başına protein özgüdür. Protein örnek buz çözme ve Kaldır toplamları aşağı…

Representative Results

Sunulan iki yöntem kinetik etkinlik ve protein etkileşimleri, substrat arasındaki bir koruyucuya dinamikleri takip olanak sağlar. Ayrıca, oksidasyon azaltma Protokolü redoks bağımlı düzensiz chaperones etkinleştirme mekanizması daha derinlemesine bir anlayış vererek bir tam olarak azaltılmış ve tam okside koruyucuya hazırlanması sağlayan. İlk olarak, ışık saçılma refakatçi redoks bağımlı etkinliğin…

Discussion

Bu yazıda, redoks bağımlı refakatçi etkinlik analizi ve yapısal değişiklikler bir istemci protein bağlama üzerine karakterizasyonu için protokolleri sağladı. Bu potansiyel refakatçi-substrat kompleksleri tanımlamak ve olası etkileşim siteleri çözümlemek için tamamlayıcı yöntemler vardır.

Burada, biz bu protokollerin iyi okudu refakatçi substrat CS ile redoks düzenlenir refakatçi Hsp33 arasında karmaşık bir karakterizasyonu için uygulanır. Biz onların kinetik v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar onun yararlı tartışmalar için Meytal Radzinski için müteşekkir ve kritik HDX analiz platformu kurmak onların sınırsız yardım için makale ve Patrick Griffin ve laboratuvar üyeleri için okuma. Yazarlar Almanca-İsrail Vakfı (ı-2332-1149.9/2012), iki uluslu Bilim Vakfı (2015056), Marie-Curie tümleştirme grant (618806), İsrail Bilim Vakfı için minnettar (1765/13 ve 2629/16) ve insan sınır bilim Mali destek programı (CDA00064/2014).

Materials

Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plus Sigma Aldrich 34998-2.5L solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich 252859 buffer
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 76-05-1 solvent
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
ZnCl2, Zinc Chloride Merck B0755416 308 reagent
DTT goldbio 27565-41-9 reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcare GE healthcare 29-9180-07 desalting column
Potassium Phosphate United states Biochemical Corporation 20274 buffer
Hydrogen peroxide 30% Merck K46809910526 oxidizing agent
citrate synthase sigma aldrich C3260 substrate
HEPES acid free sigma aldrich 7365-45-9 buffer
Gndcl sigma aldrich G3272-500G denaturant
Deuterium Chloride Solution sigma aldrich 543047-10G buffer
Deuterium Oxide 99% sigma aldrich 151882-100G solvent
TCEP bioworld 42000058-2 reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvette Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 Fluorospectrometer Jasco
Thermomixer Comfort Eppendorf 13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge Thermo Scientific
pH meter , PB-11 sartorius Sartorius 13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door COY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometer Thermo-Fischer Scientific
PAL system LHX – robotic system for handling HDX samples PAL system https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pump Thermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pump Thermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Data http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau) http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench software http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  2. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).
  3. Walker, C. L., Pomatto, L. C. D., Tripathi, D. N., Davies, K. J. A. Redox regulation of homeostasis and proteostasis in peroxisomes. Physiological Reviews. 98 (1), 89-115 (2018).
  4. Hohn, A., Konig, J., Jung, T. Metabolic syndrome, redox state, and the proteasomal system. Antioxidants & Redox Signaling. 25 (16), 902-917 (2016).
  5. Holmstrom, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
  6. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. . Free radicals in biology and medicine. , (2007).
  7. He, L., et al. Antioxidants maintain cellular redox homeostasis by elimination of reactive oxygen species. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 44 (2), 532-553 (2017).
  8. Bae, Y. S., Oh, H., Rhee, S. G., Yoo, Y. D. Regulation of reactive oxygen species generation in cell signaling. Molecules and Cells. 32 (6), 491-509 (2011).
  9. Giles, G. I. The redox regulation of thiol dependent signaling pathways in cancer. Current Pharmaceutical Design. 12 (34), 4427-4443 (2006).
  10. Qiao, J., et al. Regulation of platelet activation and thrombus formation by reactive oxygen species. Redox Biology. 14, 126-130 (2018).
  11. Milkovic, L., Siems, W., Siems, R., Zarkovic, N. Oxidative stress and antioxidants in carcinogenesis and integrative therapy of cancer. Current Pharmaceutical Design. 20 (42), 6529-6542 (2014).
  12. Duecker, R., et al. Oxidative stress-driven pulmonary inflammation and fibrosis in a mouse model of human ataxia-telangiectasia. Redox Biology. 14, 645-655 (2018).
  13. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxidants & Redox Signaling. 18 (6), 642-660 (2013).
  14. Jones, D. P. Redox theory of aging. Redox Biology. 5, 71-79 (2015).
  15. Labunskyy, V. M., Gladyshev, V. N. Role of reactive oxygen species-mediated signaling in aging. Antioxidants & Redox Signaling. 19 (12), 1362-1372 (2013).
  16. Kurian, P., Obisesan, T. O., Craddock, T. J. A. Oxidative species-induced excitonic transport in tubulin aromatic networks: potential implications for neurodegenerative disease. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 175, 109-124 (2017).
  17. Marinelli, P., et al. A single cysteine post-translational oxidation suffices to compromise globular proteins kinetic stability and promote amyloid formation. Redox Biology. 14, 566-575 (2018).
  18. Bozzo, F., Mirra, A., Carrì, M. T. Oxidative stress and mitochondrial damage in the pathogenesis of ALS: new perspectives. Neuroscience Letters. 636, 3-8 (2017).
  19. Lo Conte, M., Carroll, K. S. The redox biochemistry of protein sulfenylation and sulfinylation. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26480-26488 (2013).
  20. Reichmann, D., Jakob, U. The roles of conditional disorder in redox proteins. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 436-442 (2013).
  21. Suss, O., Reichmann, D. Protein plasticity underlines activation and function of ATP-independent chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 43 (2015).
  22. Voth, W., Jakob, U. Stress-activated chaperones: a first line of defense. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 899-913 (2017).
  23. Segal, N., Shapira, M. HSP33 in eukaryotes – an evolutionary tale of a chaperone adapted to photosynthetic organisms. The Plant Journal. 82 (5), 850-860 (2015).
  24. Dahl, J. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
  25. Winter, J., Linke, K., Jatzek, A., Jakob, U. Severe oxidative stress causes inactivation of DnaK and activation of the redox-regulated chaperone Hsp33. Molecular Cell. 17 (3), 381-392 (2005).
  26. Wang, J., Sevier, C. S. Formation and reversibility of BiP protein cysteine oxidation facilitate cell survival during and post oxidative stress. Journal of Biological Chemistry. 291 (14), 7541-7557 (2016).
  27. Zhang, H., et al. Glutathionylation of the bacterial Hsp70 chaperone DnaK provides a link between oxidative stress and the heat shock response. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6967-6981 (2016).
  28. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. Chaperone activity with a redox switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
  29. Muller, A., et al. Activation of RidA chaperone function by N-chlorination. Nature Communications. 5, 5804 (2014).
  30. Voth, W., et al. The protein targeting factor Get3 functions as ATP-independent chaperone under oxidative stress conditions. Molecular Cell. 56 (1), 116-127 (2014).
  31. Moon, J. C., et al. Oxidative stress-dependent structural and functional switching of a human 2-Cys peroxiredoxin isotype II that enhances HeLa cell resistance to H2O2-induced cell death. Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28775-28784 (2005).
  32. Wright, M. A., et al. Biophysical approaches for the study of interactions between molecular chaperones and protein aggregates. Chemical Communications. 51 (51), 14425-14434 (2015).
  33. Haslbeck, M., Vierling, E. A first line of stress defense: small heat shock proteins and their function in protein homeostasis. Journal of Molecular BIology. 427 (7), 1537-1548 (2015).
  34. Rimon, O., et al. A role of metastable regions and their connectivity in the inactivation of a redox-regulated chaperone and its inter-chaperone crosstalk. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (15), 1252-1267 (2017).
  35. Daturpalli, S., Kniess, R. A., Lee, C. T., Mayer, M. P. Large rotation of the N-terminal domain of Hsp90 is important for interaction with some but not all client proteins. Journal of Molecular Biology. 429 (9), 1406-1423 (2017).
  36. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. Journal of Biological Chemistry. 281 (24), 16493-16501 (2006).
  37. Koldewey, P., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A. Chaperone-client interactions: non-specificity engenders multifunctionality. Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12010-12017 (2017).
  38. Reichmann, D., et al. Order out of disorder: working cycle of an intrinsically unfolded chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
  39. Winter, J., Ilbert, M., Graf, P. C., Ozcelik, D., Jakob, U. Bleach activates a redox-regulated chaperone by oxidative protein unfolding. Cell. 135 (4), 691-701 (2008).
  40. Jakob, U., Eser, M., Bardwell, J. C. Redox switch of Hsp33 has a novel zinc-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 275 (49), 38302-38310 (2000).
  41. Ilbert, M., et al. The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (6), 556-563 (2007).
  42. Groitl, B., et al. Protein unfolding as a switch from self-recognition to high-affinity client binding. Nature Communications. 7, 10357 (2016).
  43. Cremers, C. M., Reichmann, D., Hausmann, J., Ilbert, M., Jakob, U. Unfolding of metastable linker region is at the core of Hsp33 activation as a redox-regulated chaperone. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11243-11251 (2010).
  44. Kumar, A., Mishra, S., Khan, E. Emerging methods for structural analysis of protein aggregation. Protein & Peptide Letters. 24 (4), 331-339 (2017).
  45. Rimon, O., Reichmann, D. Kfits: a software framework for fitting and cleaning outliers in kinetic measurements. Bioinformatics. 34 (1), 129-130 (2018).
  46. Percy, A. J., Rey, M., Burns, K. M., Schriemer, D. C. Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry – a review. Analytica Chimica Acta. 721, 7-21 (2012).
  47. Sinz, A. Divide and conquer: cleavable cross-linkers to study protein conformation and protein-protein interactions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 33-44 (2017).
  48. Sinz, A., Arlt, C., Chorev, D., Sharon, M. Chemical cross-linking and native mass spectrometry: a fruitful combination for structural biology. Protein Science. 24 (8), 1193-1209 (2015).
  49. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. Insights into eukaryotic translation initiation from mass spectrometry of macromolecular protein assemblies. Journal of Molecular Biology. 428, 344-356 (2016).
  50. Marciano, D. P., Dharmarajan, V., Griffin, P. R. HDX-MS guided drug discovery: small molecules and biopharmaceuticals. Current Opinion in Structural Biology. 28, 105-111 (2014).
  51. Mistarz, U. H., Brown, J. M., Haselmann, K. F., Rand, K. D. Probing the binding interfaces of protein complexes using gas-phase H/D exchange mass spectrometry. Structure. 24 (2), 310-318 (2016).
  52. Harrison, R. A., Engen, J. R. Conformational insight into multi-protein signaling assemblies by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Current Opinion in Structural Biology. 41, 187-193 (2016).
  53. Brown, K. A., Wilson, D. J. Bottom-up hydrogen deuterium exchange mass spectrometry: data analysis and interpretation. Analyst. 142 (16), 2874-2886 (2017).
  54. Vadas, O., Jenkins, M. L., Dornan, G. L., Burke, J. E. Using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry to examine protein-membrane interactions. Methods in Enzymology. 583, 143-172 (2017).
  55. Zanphorlin, L. M., et al. Heat shock protein 90 kDa (Hsp90) has a second functional interaction site with the mitochondrial import receptor Tom70. Journal of Biological Chemistry. 291 (36), 18620-18631 (2016).
  56. Hvidt, A., Nielsen, S. O. Hydrogen exchange in proteins. Advances in Protein Chemistry. 21, 287-386 (1966).
  57. Roberts, V. A., Pique, M. E., Hsu, S., Li, S. Combining H/D exchange mass spectrometry and computational docking to derive the structure of protein-protein complexes. 생화학. 56 (48), 6329-6342 (2017).
  58. Pascal, B. D., et al. HDX Workbench: software for the analysis of H/D exchange MS data. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (9), 1512-1521 (2012).

Tags

Hsp33Chaperone ActivityHydrogen-deuterium ExchangeMass SpectrometryOxidative StressProtein AggregationProtein DynamicsEnzyme InteractionsVisual Demonstration
check_url/kr/57806?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33’s Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image