Summary

Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Published: October 15, 2018
doi:

Summary

Wir beschreiben eine modifizierte kleine Extraktion und Farbmetrische Assays von Laktat und Pyruvat in die Nematoden C. Elegans. Bei der Verwendung von kommerziellen Assay Kits ist die technische Entwicklung ihrer Empfindlichkeit und Genauigkeit wichtig. Proteinfällung Extraktion ist der wichtigste Schritt zur quantitativen Bestimmung von intrazellulären Metaboliten.

Abstract

Laktat und Pyruvat sind wichtige Zwischenprodukte der intrazellulären Energie Stoffwechselwege. Überwachung der Laktat/Pyruvat-Verhältnis in den Zellen hilft, festzustellen, ob ein Ungleichgewicht im altersbedingten Energiestoffwechsel zwischen Mitochondrien Oxidative Phosphorylierung und aerobe Glykolyse. Hier zeigen wir die Nutzung von kommerziellen farbmetrischen Assay Kits für Laktat und Pyruvat bei Modellorganismus C. Elegans. Vor kurzem wurden durch die Forschung und Entwicklung von Reagenz Herstellern durchgeführt die Empfindlichkeit und Genauigkeit der kolorimetrischen/fluorimetrischen Assay Kits stark verbessert. Die verbesserte Reagenzien ermöglichten den Einsatz von kleinen Assays mit einer 96-Well-Platte in C. Elegans. Im Allgemeinen ist eine Antikörper-Test überlegen in der Empfindlichkeit einer kolorimetrischen Assay; Allerdings ist der kolorimetrischen Ansatz besser geeignet für den Einsatz im gemeinsamen Labors. Ein weiteres wichtiges Thema in diesen Tests zur quantitativen Bestimmung ist Eiweiß Niederschlag von homogenisierten C. Elegans Proben. In unserer Eiweiß Niederschlag Methode, gemeinsame Fällungsmitteln (zB., Trichloressigsäure Säure, Perchlorsäure und Metaphosphoric Säure) dienen zur Probenvorbereitung. Eine eiweißfreie Assay-Probe wird vorbereitet, indem man direkt kalt Fällungsmittel (Endkonzentration von 5 %) während der Homogenisierung.

Introduction

Laktat und Pyruvat-Konzentrationen gelten als Zwischenprodukte des Energiestoffwechsels, und beziehen sich auf die Staaten der Glykolyse, tricarboxylic Säure (TCA) Zyklus und Elektronentransport-Kette in den Zellen der aeroben Organismen. Eine Reihe von Reaktionen in Glykolyse oxidiert Glucose zu Pyruvat, das liegt am Scheideweg metabolische und Kohlenhydrate durch Glukoneogenese, Fettsäuren und Energiestoffwechsel durch Acetyl-CoA und die Aminosäure Alanin umgewandelt werden kann. Die TCA-Zyklus tritt unter das Vorhandensein von ausreichend gelöste Sauerstoff und ist von grundlegender Bedeutung für die Umwandlung von Glukose in Energie. Vor allem, die Veränderung des sekundärstoffwechsels ist ein interessantes Phänomen in dem Glykolyse überwiegend zur Energiegewinnung verwendet wird und mitochondriale Atmung, beinhaltet die TCA-Zyklus und Elektronentransport-Kette ist herunterreguliert in Säugetieren Krebs Zellen1,2. Wir zeigten kürzlich, dass die Laktatwerte und die konsequente Laktat/Pyruvat (L/P)-Verhältnis während der Alterung bei Modellorganismus Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) abgenommen. Ebenso fanden wir, dass der Säugetier-Tumorsuppressor p53 Ortholog CEP-1 in C. Elegans eine wichtige Rolle in der altersbedingten Veränderungen des Energiestoffwechsels durch die Aktivierung von seinen transkriptionelle Ziele3hat.

In biologischen Tests, wie die Messung von Laktat und Pyruvat-Konzentrationen in den Zellen wurden die Empfindlichkeit, Genauigkeit, Stichprobenumfang und Inkubationszeit der kolorimetrischen/fluorimetrischen Assay Kits dramatisch verbessert. Dank technologischer Innovationen können wir analysieren verschiedene Metaboliten und Fortgeschrittene Metaboliten ohne groß angelegte Kultur von C. Elegans, was angesichts seiner geringen Größe schwierig ist. Im Allgemeinen ist die Empfindlichkeit eines farbmetrischen Assays eine Größenordnung kleiner als die eines fluorimetrischen Assays; Allerdings eignet sich der kolorimetrischen Ansatz mehr im Rahmen der gemeinsamen Labors. Außerdem ist ein Extraktiontechnik, Homogenisierung und Eiweiß Niederschlag enthält für die quantitative Bestimmung von Laktat und Pyruvat Konzentrationen in C. Elegans Zellen von entscheidender Bedeutung, da diese Nematoden in ein Exoskelett eingeschlossen ist die Kutikula, im Gegensatz zu kultivierten Säugetierzellen Linien4,5genannt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu analysieren, Laktat und Pyruvat Konzentrationen mit kommerziellen farbmetrischen Assay Kits inklusive Tipps für Probe-Extraktion von C. Elegans.

Protocol

(1) synchronisierte Kultur von C. elegans Vor der Aussaat, Kultur Escherichia coli (E. Coli) Stamm OP50 über Nacht bei 37 ° C in 300 mL Brühe Flüssigmedium Luria-Bertani (LB). Speichern der kultivierten OP50 bei-4 ° C. LB Brühe flüssiges Medium zu machen, verwenden Sie 10 g Tryptone, Hefeextrakt 5 g, 10 g NaCl und 1,5 mL 1 N NaOH und 1 L mit entionisiertem Wasser hinzufügen. Autoklaven.Hinweis: OP50 und C. Elegans Stämme sind aus dem Caenorhabditis Geneti…

Representative Results

Die farbmetrischen Assays zeigten für die quantitative Bestimmung von Laktat und Pyruvat-Konzentrationen wir die Genauigkeit dieser Tests im Vergleich zu früheren Berichten in C. Elegans7,8. Hier war der Prozess der Proteinfällung während der Probe Extraktion der wichtigste Schritt um exakte Werte zu generieren. Für Proteinfällung, gemeinsame Fällungsmitteln (zB., TCA, PCA, oder Metaphosphoric Säure) kann…

Discussion

Wenn Sie diese farbmetrischen Assay Kits verwenden, ist der wichtigste Schritt in der Probengewinnung zellulärer Laktat zu erkennen und Pyruvat genau in C. Elegans der Prozess der Proteinfällung während der Homogenisierung (Abbildung 1). Es ist nicht unbedingt notwendig, eine Teflon-Homogenisator als andere Homogenisatoren zu verwenden (zB., Dounce und konisch Gewebe Schleifmaschinen oder Wulst Mühlen) eignen sich auch für die kleinen Extraktion von Würmern. Wir nicht…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch eine spezielle Research Grant Daito Bunka Universität zu Sumino Yanase finanziell unterstützt.

Materials

Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit  BioVision #K607-100 colorimetric/fluorimetric
100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate
Assay Kit
BioAssay
Systems
#EPYR-100 colorimetric/ fluorometric
100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific #23225 colorimetric assay; store at
 room temperature
Trichloroacetic Acid Wako Pure Chemical #207-04955 store at room temperature
Teflon homogenizer  Iwaki/Pyrex #358034 (Wheaton) Instead of Iwaki/Pyrex,
available by Wheaton

References

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Cite This Article
Yanase, S., Yasuda, K., Ishii, N. Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (140), e57807, doi:10.3791/57807 (2018).

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