소규모 색도계 분석 실험의 세포내 젖이 나올와 꼬마 선 충 의 선 충 Pyruvate

요약

우리는 수정 된 소규모 추출 및 젖 산 염 그리고 pyruvate는 선 충 류에서의 색도계 분석 실험 설명 C. 선 충. 상업적인 분석 키트를 이용 하는 때 그들의 감도 정확도의 기술 개발이 중요 합니다. 추출 강 수 단백질은 세포내 대사 산물의 양적 결정에 대 한 가장 중요 한 단계 이다.

초록

젖 산 염 그리고 pyruvate는 세포내 에너지 대사 경로의 핵심 중간체. 셀에 젖/pyruvate 비율 모니터링 연령과 관련 된 에너지 대사 미토 콘 드 리아 산화 인 산화 및 호 기성 분해 사이에서 불균형이 있는지 여부를 확인 도움이 됩니다. 여기, 우리는 모델 유기 체 C. 선 충에 젖 산 염 그리고 pyruvate에 대 한 상업 색도계 분석 실험 키트 활용을 보여줍니다. 최근, 감도 fluorimetric/색도계 분석 실험 키트의 정확도 개선 되었습니다 크게 연구 및 개발 시 약 제조 업체에 의해 실시. 향상 된 시 약은 C. 선 충에서 96 잘 접시와 함께 소규모 분석 실험의 사용을 활성화 했습니다. 일반적으로, fluorimetric 분석 결과 우수한 감도 색도계 분석 결과; 그러나, 색도계 방식은 일반적인 실험실에서 사용에 대 한 더 적합 합니다. 양적 결정에 대 한 이러한 분석에 또 다른 중요 한 문제는 무 균된 C. 선 충 의 단백질 강 수 샘플. 우리의 단백질 강 수 방법에서는, 일반적인 침 (예., trichloroacetic 산과 염소 산 및 metaphosphoric 산) 샘플 준비를 위해 사용 됩니다. 분석 결과 단백질 무료 샘플 직접 균질 동안 차가운 비례적 (최종 농도 5%)를 추가 하 여 준비가 되어 있습니다.

서론

젖 산 염 그리고 pyruvate 농도 에너지 대사의 중간체로 널리 그리고 분해, tricarboxylic 산 (TCA) 사이클, 에어로빅 생물의 세포에서 전자 전송 체인의 상태를 관련이 있습니다. 분해 반응의 시리즈 포도 당 변화 기로에 놓여 있으며 gluconeogenesis, 지방산 및 아 세 틸 coa, 통해 에너지 대사를 통해 탄수화물과 아미노산 알라닌 개조 될 수 있다 pyruvate에 산화. TCA 주기 충분 한 용 존된 산소의 존재에서 발생 하 고 포도 당 에너지 변환에 대 한 근본 이다. 특히, 보조 대사의 변경 분해 에너지 생산을 위한 주로 사용 되는 흥미로운 현상을 이며 TCA 주기 및 전자 전송 체인을 포함, 에어로빅 미토 콘 드리 아 호흡 downregulated 포유류 암에서 세포^1,2. 우리는 최근 젖 산 수준 및 필연적인 젖/pyruvate (L/P) 비율은 감소 모델 유기 체 꼬마 선 충 (C. 선 충)에 노화 동안 보였다. 마찬가지로, 우리는 C. 선 충 에 포유류 종양 억제기 p53 ortholog CEP-1는 transcriptional 대상³의 활성화를 통해 에....

프로토콜

1. C. 선 충 의 동기화 된 문화

1. 시드, 전에 문화 대장균 (대장균) 변형 OP50 하룻밤 Luria Bertani (파운드) 국물 액체 매체의 300 mL에 37 ° C에서. -4 ° c.에 교양된 OP50 저장
   1. LB 국물 액체 매체, tryptone의 10 g, 효 모 추출 물 5g, NaCl의 10 g 1 N NaOH의 1.5 mL를 사용 하 여와 이온 물 1 L에 추가. 오토 클레이 브.
      참고: OP50 및 C. 선 충 종자는 꼬마 유전학 센터 (미네소타의 대학, 세인트 폴, 미네소타, 미국)에서 사용할 수 있습니다.
2. 선 충 류 성장 매체 (NGM) 한 천 하 게, NaCl의 3 세대, 펩의 2.5 g, 한 천의 17 g 및 이온된 수의 975 mL을 사용 합니다. 오토 클레이 브. 55 ° C, 다음 sterilely 멋진 추가, 순서, 1 M MgSO₄의 1 mL, 1 mL의 1 M CaCl₂, 5mg/mL EtOH, 및 25 mL 1 M 칼륨 인산 염 pH 90에서 6.0의 콜레스테롤의 1 mL-mm 페 트리 접시.
   1. 1 M 칼륨 인산 염 pH 6.0에 대 한 KH₂

결과

젖 산 염 그리고 pyruvate 농도의 양적 결정에 대 한 색도계 분석 실험을 사용 하 여, 우리는 선 충 C.^7,8이전 보고서와 비교 분석 하는 이러한 실험의 정확도 보였다. 여기, 샘플 추출 하는 동안 단백질 강 수 과정은 정확한 값을 생성 하는 가장 중요 한 단계. 단백질 강 수, 일반적인 침에 대 한 (예., TCA, PCA, 또는 metaphosphoric 산) 테스트 샘플 (그림 1)를 준비 하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, C. 선 충에 벌레 (표 1)의 균질 동안 단백질 강 수를 수행 하는 데 필요한 했다. 정확도, 뿐만 아니라 이러한 분석 충분히 민감한 소규모 샘플에 젖 산 염 그리고 pyruvate 농도 측정 하.......

토론

이러한 색도계 분석 실험 키트를 활용 하면 샘플 추출 세포 젖 산을 감지 하는 가장 중요 한 단계 및 pyruvate C. 선 충 에 정확 하 게 균질 (그림 1) 동안 단백질 강 수 과정입니다. 그것은 엄격 하 게 다른 균질으로 테 플 론 균질 화기를 사용 하는 데 필요한 (예., Dounce 및 조직 그 라인 더, 또는 비드 밀 테이퍼)는 또한 벌레의 소규모 추출에 적합. 우리 검색 하지 못했습니다 셀룰러 젖 산 염 그리고 pyruvate 단백질 강 수 전에 균질 화기를 사용 하 여 추출 된 테스트 샘플에. 게다가, 젖 산 염 그리고 pyruvate 레벨 단백질 강 수 (표 1) 대신 ultracentrifugation를 사용 하 여 분리 cytosolic 분수에 크게 감소 합니다. 이러한 샘플 추출 중요 한 생 화 학적 방법론 C. 선 충선 충 류를 사용 하 여 세포 대사를 감지 하는 것이 좋.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
젖산 색도계/형광 분석 키트	BioVision	#K607-100	비색/형광 100 분석; -20oC
EnzyChrom Pyruvate Assay Kit	BioAssay Systems	#EPYR-100	colorimetric/fluorometric 100 어세이에 보관; -20oC
BCA 단백질 분석 키트	Thermo Scientific	#23225	비색 분석에 보관; 보관 장소   실온
트리클로로아세트산	Wako Pure Chemical	#207-04955	실온
테플론 균질화기에서 보관	와키/파이렉스 대신 이와키/파이	#358034(휘튼)	Wheaton에서 사용 가능

이렉스