Su piccola scala saggi colorimetrici di intracellulare lattato e piruvato nel Nematode Caenorhabditis elegans
Summary
Descriviamo un estrazione modificate su piccola scala e analisi colorimetriche del lattato e del piruvato nel nematode elegans del c. Quando si utilizzano i corredi di analisi commerciale, lo sviluppo tecnico della loro sensibilità e la precisione è importante. Precipitazione della proteina nell’estrazione è la fase più critica per la determinazione quantitativa dei metaboliti intracellulari.
Abstract
Lattato e piruvato sono intermedi chiave delle vie metaboliche di energia intracellulare. Monitoraggio del rapporto lattato/piruvato in cellule aiuta a determinare se vi è uno squilibrio nel metabolismo energetico senile tra fosforilazione ossidativa mitocondriale e glicolisi aerobica. Qui, ci mostra l’utilizzo di kit di analisi colorimetrica commerciale per lattato e piruvato nell’organismo modello di c. elegans. Recentemente, la sensibilità e la precisione dei kit colorimetrico/fluorimetrica dosaggio sono stati migliorati notevolmente dalla ricerca e sviluppo condotti da produttore di reagente. I reagenti migliorati hanno permesso l’uso di dosaggi in piccola scala con una piastra a 96 pozzetti in c. elegans. In generale, un’analisi fluorimetrica è superiore nella sensibilità a un saggio colorimetrico; Tuttavia, l’approccio colorimetrico è più adatto per l’uso nei comuni laboratori. Un’altra questione importante in queste analisi per la determinazione quantitativa è precipitazione della proteina di omogeneizzato di c. elegans campioni. Nel nostro metodo di precipitazione della proteina, precipitanti comune (ad es., acido tricloroacetico, acido perclorico e acido metafosforico) vengono utilizzati per la preparazione del campione. Un campione di analisi senza proteine è preparato aggiungendo direttamente freddo precipitante (concentrazione finale del 5%) durante l’omogeneizzazione.
Introduction
Le concentrazioni di lattato e piruvato sono ampiamente considerate come prodotti intermedi del metabolismo energetico e sono correlate agli Stati di glicolisi, ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA) e catena di trasporto degli elettroni nelle cellule degli organismi aerobici. Una serie di reazioni nella glicolisi ossidare il glucosio a piruvato, che si trova a un bivio metabolico e può essere convertito per carboidrati attraverso gluconeogenesi, acidi grassi e metabolismo energetico attraverso acetil-CoA e l’aminoacido alanina. Ciclo del TCA si verifica in presenza di sufficiente ossigeno disciolto ed è fondamentale per la conversione del glucosio in energia. Soprattutto, l’alterazione del metabolismo secondario è un fenomeno interessante in cui la glicolisi è usata principalmente per la produzione di energia e la respirazione mitocondriale aerobica, che coinvolge il ciclo del TCA e la catena di trasporto degli elettroni, è downregulated in mammiferi cancro cellule1,2. Abbiamo mostrato recentemente che i livelli di lattato e il rapporto lattato/piruvato conseguente (L/P) è diminuito durante l’invecchiamento dell’organismo modello Caenorhabditis elegans (c. elegans). Allo stesso modo, abbiamo trovato che il mammifero tumore soppressore p53 ortholog CEP-1 c. elegans ha un ruolo importante nelle alterazioni del metabolismo energetico attraverso l’attivazione dei suoi bersagli trascrizionali3età-correlate.
In saggi biologici, come la misurazione delle concentrazioni di lattato e piruvato in cellule, sono stati migliorati drammaticamente la sensibilità, precisione, dimensione del campione e tempo di incubazione di kit di saggio colorimetrico/fluorimetrico. A causa di innovazioni tecnologiche, siamo ora in grado di analizzare vari metaboliti e metaboliti intermedi senza la cultura su larga scala di c. elegans, che è difficile date le sue piccole dimensioni. In generale, la sensibilità di un saggio colorimetrico è un ordine di grandezza più piccolo di quello di un’analisi fluorimetrica; Tuttavia, l’approccio colorimetrico è più adatto nella cornice di laboratori comuni. Inoltre, una tecnica di estrazione contenente la precipitazione della proteina e di omogeneizzazione è cruciale per la determinazione quantitativa delle concentrazioni di lattato e piruvato in cellule di c. elegans , perché questo nematode è racchiuso in un esoscheletro chiamato la cuticola, a differenza di linee cellulari di mammifero coltivate4,5. Qui, descriviamo un protocollo per analizzare le concentrazioni di lattato e piruvato usando i kit di analisi colorimetrica commerciali compresi suggerimenti per l’estrazione del campione da c. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quando si utilizzano questi kit di analisi colorimetrica, la fase più critica nell’estrazione del campione per rilevare cellulare del lattato e del piruvato con precisione in c. elegans è il processo di precipitazione della proteina durante l’omogeneizzazione (Figura 1). Non è strettamente necessario utilizzare un omogeneizzatore di Teflon, come altri omogeneizzatori (ad es., lisata e conico smerigliatrici del tessuto, o mulini del branello) sono adatti anche per l’estra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da una sovvenzione speciale di ricerca da Daito Bunka University a Sumino Yanase.
Materials
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
References
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