Summary

Мелких колориметрические Assays внутриклеточных лактата и пирувата в нематоды Caenorhabditis elegans

Published: October 15, 2018
doi:

Summary

Мы описываем изменение мелкомасштабной добычи и колориметрические анализов лактата и пирувата в нематода C. elegans. При использовании коммерческих пробирного наборы, техническое развитие их чувствительность и точность имеет важное значение. Осадков белок в добыче является наиболее важным этапом для количественного определения внутриклеточных метаболитов.

Abstract

Лактата и пирувата являются ключевыми интермедиатов внутриклеточных энергии метаболических. Мониторинг соотношения молочной кислоты/пирувата в клетках помогает определить, является ли есть дисбаланс в метаболизме энергии, связанных с возрастом между митохондриальной окислительного фосфорилирования и аэробного гликолиза. Здесь мы покажем использование коммерческих колориметрического анализа комплектов для лактата и пирувата в организме модель C. elegans. Недавно чувствительность и точность колориметрии/Флуориметрическое пробирного наборы были значительно улучшилось, научных исследований и разработок, проводимых производителями реагента. Улучшенная реагентов позволили использование мелких анализов с 96-луночных пластины в C. elegans. В общем Флуориметрическое пробирного превосходит в чувствительности колориметрического анализа; Однако колориметрические подход больше подходит для использования в общих лабораториях. Еще одним важным вопросом в этих анализов для количественного определения является белок осадков гомогенизированные C. elegans образцы. В методе осадков белок, общие выделений (например., трихлоруксусная кислота, хлорной кислоты и metaphosphoric кислоты) используются для пробоподготовки. Бесплатно белка пробирного образец готовится непосредственно добавив холодной осадителя (конечной концентрации 5%), во время гомогенизации.

Introduction

Концентрации лактата и пирувата широко рассматривается как промежуточные энергии метаболизма и связаны в Штаты гликолиза, цикла трикарбоновой кислоты (TCA) и электрон-транспортной цепи в клетках аэробных организмов. Серию реакций в гликолизе окисления глюкозы пируват, который находится на перепутье метаболических и могут быть преобразованы для углеводов через глюконеогенез, жирных кислот и метаболизм энергии через ацетил-КоА и аминокислота аланин. TCA цикл происходит при наличии достаточного количества растворенного кислорода и является основополагающим для преобразования глюкозы энергии. Особенно изменение вторичного метаболизма является интересным феноменом, в котором гликолиз используется преимущественно для производства энергии и аэробных митохондриальное дыхание, который включает цикл ТСА и электрон-транспортной цепи, downregulated в млекопитающих рака клеток в1,2. Недавно мы показали, что уровень лактата и последующее лактата в пирувата (L/P) соотношение уменьшилось во время старения в организме модель Caenorhabditis elegans (C. elegans). Аналогичным образом мы обнаружили, что млекопитающих опухоли ortholog подавитель p53 ВИС-1 в C. elegans имеет важную роль в возрастных изменений метаболизма энергии путем активации его транскрипционный анализ цели3.

В биологических анализов, например измерения концентрации лактата и пирувата в клетках чувствительность, точность, размер выборки и время инкубации колориметрии/Флуориметрическое пробирного комплектов были улучшены резко. Благодаря технологическим новшествам теперь мы можем анализировать различные метаболиты и промежуточных метаболитов без крупномасштабных культуры C. elegans, который трудно, учитывая ее небольшие размеры. В общем чувствительность колориметрического анализа является на порядок меньше, чем Флуориметрическое анализа; Однако колориметрические подход больше подходит в установлении общих лабораториях. Кроме того метод извлечения, содержащие гомогенизации и белка осадков имеет решающее значение для количественного определения концентраций лактата и пирувата в C. elegans клетки, потому что этот нематода заключена в экзоскелет под названием кутикулы, в отличие от mammalian клетки культивировали линии4,5. Здесь мы описываем протокол для анализа концентрации лактата и пирувата, с помощью коммерческих колориметрического анализа комплектов, включая советы для извлечения образца из C. elegans.

Protocol

1. синхронизированные культуры C. elegans Перед посевом, культура Escherichia coli (E. coli) штамма ОР50 на ночь при 37 ° C в 300 мл жидкой среды бульон Бертани Лурия (LB). Магазин искусственный ОР50-4 ° c. Чтобы сделать LB отвара жидкой среды, используйте 10 g Триптон, 5 г экстракта дрожжей, 10 ?…

Representative Results

С помощью колориметрических анализов для количественного определения концентрации лактата и пирувата, мы показали точность этих анализов, по сравнению с предыдущими докладами в C. elegans7,,8. Здесь процесс белка осадков во время извле?…

Discussion

При использовании этих колориметрических пробирного наборы, наиболее важным этапом в пример извлечения для обнаружения клеточных лактата и пирувата точно в C. elegans является процесс белка осадков во время гомогенизации (рис. 1). Это не строго необходимо использовать …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была финансово поддержана специальный исследовательский грант от Дайто Бунка университета для Сумино Янасэ.

Materials

Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit  BioVision #K607-100 colorimetric/fluorimetric
100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate
Assay Kit
BioAssay
Systems
#EPYR-100 colorimetric/ fluorometric
100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific #23225 colorimetric assay; store at
 room temperature
Trichloroacetic Acid Wako Pure Chemical #207-04955 store at room temperature
Teflon homogenizer  Iwaki/Pyrex #358034 (Wheaton) Instead of Iwaki/Pyrex,
available by Wheaton

References

  1. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
  2. Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
  3. Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
  4. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
  5. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
  6. Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).
  7. Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
  8. Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
  9. Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
  10. Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).

Play Video

Cite This Article
Yanase, S., Yasuda, K., Ishii, N. Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (140), e57807, doi:10.3791/57807 (2018).

View Video