Småskaliga kolorimetriska analyser av intracellulära laktat och pyruvat i den nematoder Caenorhabditis elegans
Summary
Vi beskriver en modifierad småskalig utvinning och kolorimetriska analyser av laktat och pyruvat i Nematoden C. elegans. När utnyttja kommersiella assay kit, är den tekniska utvecklingen av sin känslighet och noggrannhet viktigt. Protein nederbörd i utvinning är det mest kritiska steget för kvantitativ bestämning av intracellulära metaboliter.
Abstract
Laktat och pyruvat är viktiga intermediärer av intracellulära energi metaboliska vägar. Övervakning laktat/pyruvat förhållandet i celler hjälper till att avgöra om det finns en obalans i åldersrelaterad energimetabolism mellan mitokondriell oxidativ fosforylering och aerob glykolys. Här visar vi utnyttjande av kommersiella kolorimetrisk test kit för laktat och pyruvat i modell organismen C. elegans. Nyligen, känslighet och noggrannhet av de kolorimetriska/fluorimetriskt assay Kit har förbättrats avsevärt genom forskning och utveckling som genomförs av Reagenstillverkare. Förbättrad reagenserna har aktiverat användningen av småskaliga försök med en plattan med 96 brunnar i C. elegans. I allmänhet är en fluorimetriskt analys överlägsen känslighet en kolorimetrisk test; men är den kolorimetriska metoden mer lämplig för användning i vanliga laboratorier. En annan viktig fråga i dessa analyser för kvantitativ bestämning är protein utfällning av homogeniserad C. elegans prover. I vår protein nederbörd metod, gemensamma precipitants (t.ex., triklorättiksyra, perklorsyra och metaphosphoric syra) används för provberedning. Ett protein-fria assay prov förbereds genom att direkt lägga kallt fällningsmedel (slutliga koncentration av 5%) under homogenisering.
Introduction
Laktat och pyruvat koncentrationer betraktas allmänt som intermediärer av energimetabolism, och är besläktade med påstår av glykolys, tricarboxylic syra (TCA) cykel och elektron transportkedjan i cellerna av aeroba organismer. En serie reaktioner i glykolys oxiderar glukos till Pyruvat, som ligger vid skiljevägen metabola och kan omvandlas till kolhydrater genom glukoneogenes, fettsyror och energiomsättning via acetyl-CoA och till den aminosyran alanin. TCA cykeln inträffar under närvaro av tillräckligt löst syre och är grundläggande för omvandlingen av glukos till energi. Särskilt, förändring av sekundär metabolism är ett intressant fenomen där glykolys används huvudsakligen för produktion av energi och aerob mitokondriell andning, som innebär den TCA cykeln och elektron transportkedjan, är nedreglerade i däggdjur cancer celler1,2. Vi visade nyligen att laktat nivåer och åtföljande laktat/pyruvat (L/P) förhållandet minskat under åldrandet i modell organismen Caenorhabditis elegans (C. elegans). Jämväl, Vi hittade att det däggdjur tumör suppressor p53 ortholog CEP-1 i C. elegans har en viktig roll i de åldersrelaterade förändringarna av energimetabolism genom aktivering av dess transkriptionell mål3.
I biologiska analyser, såsom mätning av laktat och pyruvat i celler, har den känslighet, noggrannhet, urvalsstorlek och inkubationstid av kolorimetriska/fluorimetriskt assay kit förbättrats dramatiskt. På grund av tekniska innovationer är vi nu kunna analysera olika metaboliter och mellanliggande metaboliter utan storskaliga kulturen i C. elegans, vilket är svårt med tanke på dess ringa storlek. Känsligheten hos en kolorimetrisk test är i allmänhet en storleksordning som är mindre än en fluorimetriskt analys; den kolorimetriska metoden är dock mer passande i fastställandet av gemensamma laboratorier. Dessutom är en utvinning teknik som innehåller homogenisering och protein fällning avgörande för kvantitativ bestämning av laktat och pyruvat koncentrationer i C. elegans celler eftersom denna nematod är inbakad i ett exoskelett kallas nagelband, till skillnad från odlade däggdjursceller linjerna4,5. Här beskriver vi ett protokoll för att analysera laktat och pyruvat koncentrationer med kommersiella kolorimetrisk test kit inklusive tips för provet extraktion från C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
När utnyttja dessa kolorimetriska assay kit, är det mest kritiska steget i provet utvinning att upptäcka cellulära laktat och pyruvat korrekt i C. elegans en process av protein nederbörd under homogenisering (figur 1). Det är inte absolut nödvändigt att använda en Teflon Homogenisatorer, som andra Homogenisatorer (t.ex., Dounce och avsmalnande vävnad slipmaskiner eller pärla mills) är också lämpade för småskalig utvinning av maskar. Vi upptäcka inte cellul?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes ekonomiskt av en särskild forskningsanslag från Daito Bunka universitet till Sumino Yanase.
Materials
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
References
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
- Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).
- Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
- Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
- Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
- Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).
