השוואה ברזולוציה גבוהה של תדרים קוניוגציה
Summary
תוך שאיפה להבין את אופני הפעולה של חיידקי conjugative DNA אלמנטים שונים בתנאים שונים, אנו מתארים את פרוטוקול זיהוי הבדלים תדר ההטיה, עם רזולוציה גבוהה, כדי להעריך באיזו מידת יעילות החיידק התורם יוזם ההטיה.
Abstract
קוניוגציה היא צעד חשוב בהעברת אופקי גנים עמידות לאנטיביוטיקה דרך אלמנט דנ א conjugative. חומר השוואתי של תדר ההטיה בתנאים שונים נדרשים להבין איך הרכיב conjugative מתפשט בטבע. עם זאת, שיטות קונבנציונליות להשוואת ההטיה תדירות אינם מתאימים עבור חומר השוואתי בגלל הרקע גבוה נגרם על-ידי ההתרחשות של אירועים נוספים ההטיה בצלחת סלקטיבי. בהצלחה הורדנו את הרקע על ידי החדרת שיטת (MPN) מספר הסביר ביותר, ריכוז גבוה יותר של אנטיביוטיקה כדי למנוע ההטיה במדיום נוזלי סלקטיבי. בנוסף, פיתחנו פרוטוקול עבור הערכת ההסתברות של איך לעיתים קרובות ההטיה אתחול של תאי התורם על-ידי מיון תאי התורם יחיד לתוך בריכות הנמען על ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS). בעזרת פלסמידים 2, pBP136, pCAR1, ההבדלים ההטיה תדירות בתאים Pseudomonas putida יכול להתגלות במדיום נוזלי בקצב מלהיב שונה. התדרים של חניכה ההטיה היו גבוהים עבור pBP136 מאשר עבור pCAR1. באמצעות תוצאות אלו, שנוכל להבין את תכונות ההטיה באלה פלסמידים 2.
Introduction
קוניוגציה של מרכיבים גנטיים ניידים, פלסמידים conjugative אלמנטים אינטגרטיבית של conjugative (גלידות) חשוב התפשטות אופקית של מידע גנטי. זה יכול לקדם את ההתפתחות המהירה חיידקי והתאמה ושידור של התנגדות multidrug גנים1,2. תדירות ההטיה עשויה להיות מושפעת חלבונים המקודדים על רכיבי conjugative גיוס של DNA (מאפיה), זוג ההזדווגות היווצרות (MPF), כולל סקס pili, הממויינות לפי המאפיה של MPF type3,4, 5. זה יכול להיות מושפעת גם את התורם וחתן זוג6 ו לתנאי גדילה תאים7,8,9,10,11,12 ( שיעור הצמיחה, צפיפות תא, משטח מוצק או נוזלי בינוני, טמפרטורה, זמינות חומרי הזנה, הנוכחות של קטיונים). כדי להבין כיצד היסודות conjugative להפיץ בין חיידקים, זה הכרחי להשוות תדר ההטיה בפירוט.
תדירות ההטיה בין התורמים לבין הנמען זוגות לאחר ההזדווגות בדרך כלל מוערך על ידי שיטות קונבנציונליות כדלקמן. (א) ראשית, המספרים של המושבות התורם וחתן ייספרו; (ii) ואז נספרים המושבות הנמען, אשר קיבל את הרכיבים conjugative (= transconjugants); (iii), לבסוף, התדר ההטיה הוא מחושב על ידי חלוקת המושבה הקמת יחידות (CFU) transconjugants על ידי אלה של התורם ו/או נמען13. כאשר משתמשים בשיטה זו, הרקע זאת, עקב אירועים נוספים ההטיה עלול להתרחש גם על לוחות סלקטיבי והשיג transconjugants כאשר צפיפות התאים היא גבוהה10גבוה. לכן קשה לזהות הבדלים קטנים תדירות (להלן הבדל 10-fold). אנחנו לאחרונה הציג שיטה (MPN) מספר הסביר ביותר באמצעות מדיום נוזלי המכיל ריכוז גבוה יותר של אנטיביוטיקה. בשיטה זו צמצמה את הרקע על ידי עיכוב נוסף ההטיה במדיום סלקטיבי; לפיכך, תדירות ההטיה יכול להיות מוערך עם רזולוציה גבוהה יותר.
ההטיה יכול להיות מחולק לשלושה שלבים: (1) החזקה של הנמען התורם זוג (2) חניכה של העברת conjugative, ו- (3) דיסוציאציה של זוג14. במהלך השלבים (1) ו- (3), יש מגע פיזי בין התורם ובין תאים הנמען; לפיכך, צפיפות התאים, תנאים סביבתיים יכולים להשפיע על השלבים הבאים, למרות התכונות של pili המין חשובים גם. שלב (2) סביר להניח מוסדר על ידי הביטוי של מספר גנים המעורבים ב נטיה בתגובה לשינויים חיצוניים, אשר יכולה להיות מושפעת תכונות שונות של פלסמיד, התורם, הנמען. למרות החזקה פיזית או ניתוק של זוגות התורם-נמען יכול להיות מבחינה מתמטית מדומה באמצעות הערכה מהירה של תאים כמו חלקיקים, התדירות של שלב (2) יש השפעול למדוד. היו כמה דוחות על תצפיות ישירות על איך לעיתים קרובות תורמים יכולים ליזום ההטיה [שלב (2)] באמצעות קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ15,16; עם זאת, שיטות אלה אינן תפוקה גבוהה כי מספר גדול של תאים חייב להיות במעקב. לכן, פיתחנו שיטה חדשה כדי להעריך את ההסתברות להתרחשות של שלב (2) על-ידי שימוש תא פלורסצנטיות מופעל מיון (FACS). השיטה שלנו ניתן ליישם כל פלסמיד, ללא זיהוי של גנים חיוניים עבור ההטיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ברזולוציה גבוהה לגילוי הבדלים ההטיה תדירות בתנאים שונים, באמצעות שיטה MPN כדי להעריך את מספר transconjugants. צעד חשוב בפרוטוקול זה דילול התערובת של התורם ואת המטופל לאחר ההזדווגות עד אין transconjugants לגדול. צעד נוסף הוא הוספת ריכוזים גבוהים של אנטיביוטיקה המדיום הנוזלי סלקטי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר ק’ Kamachi של לאומי המכון של המחלות הזיהומיות (יפן) על מתן pBP136 פרופ ‘ ד ר Nojiri ה באוניברסיטת טוקיו (יפן) מתן pCAR1. אנחנו גם מודה ד ר פרופסור Molin Sølen של האוניברסיטה הטכנית של דנמרק על מתן pJBA28. עבודה זו נתמכה על ידי JSPS KAKENHI (גרנט מספרי 15H 05618, 15KK0278) ל MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
References
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work. Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).
- Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
- Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).
- Shintani, M., et al. Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains. Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).
- Yanagida, K., et al. Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).
- Schuurmans, J. M., et al. Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains. Plasmid. 72, 1-8 (2014).
- Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).
- Nakazawa, S., et al. Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions. PLoS One. 12 (10), e0186248 (2017).
- Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent. Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).
- Sakuda, A., et al. Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts. Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).
- Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples. Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).
- Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics. Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).
- Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E. The cytology of bacterial conjugation. EcoSal Plus. 2004, (2004).
- Minoia, M., et al. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).
- Kamachi, K., et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).
- Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).
- Shintani, M., et al. Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).
- Shintani, M., et al. Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).
- Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).
- Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements. FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).
- Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Maeda, K., et al. Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676. Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).
- Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).
