बैक्टीरियल विकार आवृत्तियों की उच्च संकल्प तुलना
Summary
विभिंन स्थितियों के तहत विभिंन बैक्टीरियल conjugative डीएनए तत्वों के व्यवहार को समझने के लिए एक उद्देश्य के साथ, हम विकार आवृत्ति में मतभेदों का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, उच्च संकल्प के साथ, अनुमान लगाने के लिए कैसे कुशलतापूर्वक दाता जीवाणु आरंभ विकार ।
Abstract
बैक्टीरियल विकार एक conjugative डीएनए तत्व के माध्यम से एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के क्षैतिज हस्तांतरण में एक महत्वपूर्ण कदम है । विभिंन स्थितियों के तहत विकार आवृत्ति की गहराई में तुलना समझ में कैसे conjugative तत्व प्रकृति में फैलता है की आवश्यकता है । हालांकि, विकार आवृत्ति की तुलना के लिए पारंपरिक तरीकों में गहराई से तुलना के लिए उपयुक्त नहीं है क्योंकि उच्च पृष्ठभूमि के चयनात्मक प्लेट पर अतिरिक्त विकार घटनाओं की घटना की वजह से । हम सफलतापूर्वक एक सबसे संभावित संख्या (सीपीसीबी) विधि शुरू करने और एंटीबायोटिक दवाओं के एक उच्च एकाग्रता के लिए चयनात्मक तरल माध्यम में आगे विकार को रोकने के द्वारा पृष्ठभूमि कम । इसके अलावा, हम कितनी बार दाता कोशिकाओं प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा प्राप्तकर्ता पूल में एकल दाता कोशिकाओं छंटाई द्वारा विकार आरंभ की संभावना का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है । दो plasmids, pBP136 और pCAR1 का प्रयोग, Pseudomonas putida कोशिकाओं में विकार आवृत्ति में अंतर अलग सरगर्मी दरों पर तरल माध्यम में पाया जा सकता है । विकार दीक्षा की आवृत्तियों pCAR1 के लिए की तुलना में pBP136 के लिए उच्च थे । इन नतीजों का इस्तेमाल करके हम इन दोनों plasmids में विकार फीचर्स को बेहतर तरीके से समझ सकते हैं ।
Introduction
बैक्टीरियल विकार के मोबाइल आनुवंशिक तत्वों, conjugative plasmids, और एकीकृत और conjugative तत्वों (ICEs) आनुवंशिक जानकारी के क्षैतिज प्रसार के लिए महत्वपूर्ण है । यह तेजी से जीवाणु विकास और अनुकूलन को बढ़ावा देने और बहुऔषध प्रतिरोध जीन1,2संचारित कर सकते हैं । विकार आवृत्ति डीएनए (भीड़) और संभोग युग्म गठन (MPF), सेक्स पिली, जो भीड़ और MPF प्रकार3,4के अनुसार वर्गीकृत कर रहे है सहित के लिए conjugative तत्वों पर इनकोडिंग प्रोटीन से प्रभावित किया जा सकता है, 5. यह भी दाता और प्राप्तकर्ता जोड़ी6 और कोशिकाओं की वृद्धि की स्थिति से प्रभावित कर सकते है7,8,9,10,11,12 ( विकास दर, कोशिका घनत्व, ठोस सतह या तरल मध्यम, तापमान, पोषक तत्वों की उपलब्धता, और cations की उपस्थिति) । कैसे बैक्टीरिया के बीच फैले conjugative तत्वों को समझने के लिए, यह विस्तार से विकार आवृत्ति की तुलना करने के लिए आवश्यक है ।
दाता और संभोग के बाद प्राप्तकर्ता जोड़े के बीच विकार आवृत्ति आमतौर पर इस प्रकार के रूप में पारंपरिक तरीकों से अनुमानित हैं । (i) सबसे पहले, दाता और प्राप्तकर्ता की कालोनियों की संख्या गिनी जाती है; (ii) फिर, प्राप्तकर्ता कालोनियों, जो conjugative तत्व प्राप्त (= transconjugants) गिना जाता है; (iii) और अंत में, विकार आवृत्ति की गणना कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) द्वारा transconjugants के दाता और/या13प्राप्तकर्ता के द्वारा की जाती है । हालांकि, जब इस विधि का उपयोग करते हुए, पृष्ठभूमि उच्च है के कारण अतिरिक्त विकार घटनाओं पर भी हो सकता है कि चुनिंदा प्लेटों transconjugants प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जब कोशिका घनत्व उच्च10है । इसलिए, यह आवृत्ति (एक 10-गुना अंतर के नीचे) में छोटे मतभेदों का पता लगाने के लिए मुश्किल है । हम हाल ही में एक सबसे संभावित संख्या (सीपीसीबी) तरल एंटीबायोटिक दवाओं की एक उच्च एकाग्रता युक्त माध्यम का उपयोग कर विधि शुरू की । इस विधि चयनात्मक माध्यम में आगे विकार बाधा द्वारा पृष्ठभूमि कम; इस प्रकार, विकार आवृत्ति उच्च संकल्प के साथ अनुमान लगाया जा सकता है ।
विकार को तीन चरणों में बाँटा जा सकता है: (१) दाता की आसक्ति-प्राप्तकर्ता की जोड़ी (२) conjugative अंतरण की दीक्षा, और (३) पृथक्करण की जोड़ी१४. कदम के दौरान (1) और (3), वहां दाता और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के बीच शारीरिक संपर्क है; इस प्रकार, कोशिका घनत्व और पर्यावरणीय स्थितियाँ इन कदमों को प्रभावित कर सकती हैं, हालाँकि सेक्स पिली की विशेषताएँ भी महत्वपूर्ण हैं. कदम (2) की संभावना कई बाहरी परिवर्तन है, जो प्लाज्मिड, दाता, और प्राप्तकर्ता की विभिंन सुविधाओं से प्रभावित हो सकता है के जवाब में विकार में शामिल जीन की अभिव्यक्ति द्वारा विनियमित है । हालांकि शारीरिक लगाव या दाता-प्राप्तकर्ता जोड़े की टुकड़ी गणितीय रूप से कणों के रूप में कोशिकाओं का एक आकलन का उपयोग कर अनुकरण किया जा सकता है, कदम (2) की आवृत्ति प्रयोग मापा जाना चाहिए । वहां कितनी बार दाताओं विकार शुरू कर सकते है [कदम (2)] प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी15,16का उपयोग कर के प्रत्यक्ष टिप्पणियों पर कुछ रिपोर्टों गया है; बड़ी संख्या में कक्षों की निगरानी की जानी चाहिए, क्योंकि हालांकि, इन विधियों उच्च प्रवाह नहीं हैं । इसलिए, हम प्रतिदीप्ति सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) का उपयोग करके चरण (2) की आवृत्ति की प्रायिकता का अनुमान लगाने के लिए एक नई विधि विकसित की है । हमारी विधि किसी भी प्लाज्मिड के लिए लागू किया जा सकता है, विकार के लिए आवश्यक जीन की पहचान के बिना ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम transconjugants की संख्या का अनुमान लगाने के लिए एक सीपीसीबी विधि का उपयोग करते हुए विभिन्न स्थितियों के तहत विकार आवृत्ति में मतभेदों का पता लगाने के लिए एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते है…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pCAR1 प्रदान करने के लिए टोक्यो विश्वविद्यालय (जापान) के pBP136 और प्रो डॉ एच Nojiri प्रदान करने के लिए हम राष्ट्रीय संक्रामक रोग संस्थान (जापान) के कमाची डॉ. हम pJBA28 प्रदान करने के लिए डेनमार्क के तकनीकी विश्वविद्यालय के प्रोफेसर डॉ Molin Sølen के भी आभारी हैं. इस काम को JSPS KAKENHI (ग्रांट नंबर्स 15H05618 और 15KK0278) ने एमएस (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/) को सपोर्ट किया था ।
Materials
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
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