세균성 활용 주파수의 고해상도 비교
Summary
우리가 활용 빈도, 얼마나 효율적으로 예측 하려면 높은 해상도에 차이 탐지 하기 위한 프로토콜을 설명 하는 다양 한 세균성 conjugative DNA 요소 다른 조건 하에서 동작을 이해 하는 목표로, 기증자 박테리아 활용을 시작합니다.
Abstract
세균성 활용 conjugative DNA 요소를 통해 항생제 저항 유전자의 수평 이동에 중요 한 단계는 이다. 다른 조건 하에서 활용 주파수의 심층 비교 자연에서 conjugative 요소를 확산 하는 방법 이해 해야 합니다. 그러나, 활용 빈도 비교 하기 위한 기존의 방법 않습니다 심층 비교에 대 한 적절 한 선택에 추가 활용 이벤트의 발생으로 인 한 높은 배경 때문에. 우리는 성공적으로 가능성이 가장 높은 숫자 (MPN) 메서드와 선택적 액체 매체에서 활용을 더 방지 하기 위하여 항생제의 높은 농도 도입 하 여 백그라운드를 감소. 또한, 우리 개발 종종 방법의 확률을 추정을 위한 프로토콜 기증자 세포 시작 활용 형광 활성화 된 세포 (FACS)를 정렬 하 여 받는 사람 풀으로 하나의 기증자 셀을 정렬 하 여. 두 개의 플라스 미드를 사용 하 여, 다른 교 반 속도로 액체 매체에서 pBP136 및 pCAR1, 슈 도모 나 스 putida 셀 활용 주파수에서 차이 검출 될 수 있습니다. 활용 개시의 주파수는 pCAR1에 대 한 보다 pBP136에 대 한 더 높았다. 이러한 결과 사용 하 여, 우리가 더 나은 이러한 두 plasmids의 활용 기능을 이해할 수 있다.
Introduction
세균성 활용 모바일 유전 요소, conjugative 플라스 미드, 그리고 통합 및 conjugative 요소 (얼린 다)의 유전 정보의 수평 확산에 대 한 중요 하다. 그것은 급속 한 세균성 발전 및 적응을 홍보 하 고 multidrug 저항 유전자1,2를 전송할 수 있습니다. 활용 빈도 단백질 DNA (폭도)와 짝짓기 쌍 형성 (MPF)의 동원에 대 한 conjugative 요소에 인코딩된 섹스 pili, 폭도 및 MPF 유형3,4에 따르면 분류 된다를 포함 하 여 영향을 받을 수합니다 있습니다. 5. 그것은 또한 기증자와 받는 사람 쌍6 와 셀7,8,9,10,,1112 (의 성장 조건에 의해 영향을 받을 수합니다 있습니다. 성장 율, 세포 밀도, 고체 표면 또는 액체 매체, 온도, 양분 가용성 및 양이온의 존재). Conjugative 요소 박테리아 사이에서 확산 하는 방법을 알아야 자세히 활용 주파수를 비교할 필요가 있다.
기증자와 짝짓기 후 받는 사람 쌍 사이 활용 주파수는 다음과 같이 기존의 방법으로 추정 일반적으로. (i) 먼저, 기증자와 받는 사람 식민지의 숫자 계산 됩니다; (ii) 다음, conjugative 요소 (= transconjugants)를 받은 받는 사람 식민지 세 어진다; (iii) 그리고 마지막으로, 활용 주파수 기증자 또는 받는 사람13그는 transconjugants의 단위 (CFU)를 형성 하는 식민지를 나누어 계산 됩니다. 그러나,이 메서드를 사용 하면 배경은 높은 셀 밀도 높은10때 transconjugants를 사용 하는 선택적 접시에도 발생할 수 있습니다 추가 활용 이벤트 때문 이다. 따라서, 주파수 (아래 사진 차이)에 작은 차이 감지 하기가 어렵습니다. 우리는 최근에 항생제의 높은 농도 포함 하는 액체 매체를 사용 하 여 가능성이 가장 높은 숫자 (MPN) 방법을 소개 했다. 이 방법은 더 선택적 매체;에 활용을 억제 함으로써 배경 감소 따라서, 활용 빈도 높은 해상도와 추정 될 수 있습니다.
활용 3 단계로 분할 될 수 있다: (1) 기증 받는 첨부 파일 쌍의 conjugative 전송 개시 (2) 및 (3) 쌍14의 분리. 단계 (1) 및 (3), 하는 동안은 물리적 상호작용 기증자와 받는 사람 세포; 따라서, 셀 밀도 및 환경 조건 좌우할 수 있다이 단계, 비록 성 pili의 기능 또한 중요 하다. (2) 단계는 가능성이 플라스 미드, 기증자와 받는 사람의 다양 한 기능에 의해 영향을 받을 수 있는 외부 변화에 대응 활용에 관련 된 여러 유전자의 표현에 의해 규제 됩니다. 실제 첨부 파일 또는 기증자 받는 쌍의 분리 수학적으로 시뮬레이션할 수 입자로 셀의 추정을 사용 하 여, 비록 단계 (2)의 주파수는 실험적으로 측정 되어야 한다. 몇 가지 보고 방법의 직접 관찰에 종종 기증자 활용 [단계 (2)] 형광 현미경 검사 법15,16;를 사용 하 여 시작할 수 있습니다 되었습니다 그러나, 이러한 방법은 셀의 많은 수를 모니터링 해야 하기 때문에 높은 처리 되지 않습니다. 따라서, 우리는 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 사용 하 여 단계 (2)의 발생 가능성을 예측 하는 새로운 방법을 개발. 우리의 방법 활용에 대 한 필수적인 유전자의 id 없이 어떤 플라스 미드에 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리 transconjugants의 수를 추정 하는 MPN 방법을 사용 하 여 다른 조건 하에서 활용 주파수 차이 탐지 하기 위한 고해상도 프로토콜 제시. 프로토콜의 한 중요 한 단계 아니 transconjugants 성장 때까지 짝짓기 후 기증자와 받는 사람의 혼합물을 diluting은. 또 다른 단계는 선택적 액체 매체 활용을 더 방지 하기 위하여 항생제의 높은 농도 추가 하 고. 이 절차는 배경 선택적 매체에 더 활용으로 인 한…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 제공 하는 pCAR1 pBP136 및 교수 박사 헤 노 지리 동경 (일본)의 제공을 위한 닥터 K. 아마의 국립 연구소의 전염병 (일본) 감사 합니다. 우리는 또한 제공 하는 pJBA28에 대 한 덴마크의 기술적인 대학의 교수, 박사 Molin Sølen에 감사입니다. 이 작품은 JSP KAKENHI에 의해 지원 되었다 (부여 번호 15 H 05618와 15KK0278) 석사 (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
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